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237 Pages · 2008 · 8.99 MB · German

Reduzierte Dicyanovinyl-Farbstoffe (ETHT 5003-5009), eine. Klasse neu¬ artiger, neutraler Indikatoren, wurden isoliert und in weichgemachten. PVC-Membransystemen charakterisiert. Diese Chromoionophore zeich¬ neten sich in der Optodenmembran durch eine ausserordentlich hohe chemische 

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Research Collection Doctoral Thesis Bestimmung von Elektrolyten im Blutplasma mit chemischen Sensoren und die Verarbeitung der Rohdaten und Farbstoffe mit Absorptionsbanden im nahen InfrarotSpektralbereich für den Einsatz in optischen Sensoren Author(s): Citterio, Daniel Publication Date: 1998 Permanent Link: https://doiorg/103929/ethza001890759 Rights / License: In Copyright NonCommercial Use Permitted This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection For more information please consult the Terms of use ETH Library Diss ETH Nr 12503 Bestimmung von Elektrolyten in Blutplasma mit chemischen Sensoren und die Verarbeitung der Rohdaten und Farbstoffe mit Absorptionsbanden im nahen Infrarot Spektralbereich für den Einsatz in optischen Sensoren ABHANDLUNG zur Erlangung des Titels DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN der EIDGENOSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE ZÜRICH vorgelegt von Daniel Citteno Dipl Chem ETH geboren am 17 Dezember 1967 von Zürich (ZH) Angenommen auf Antrag von Prof Dr G Folkers, Reierent PD Dr UE Spichiger, Korreferentin Prof Dr UP Wild, Korreferent Zürich 1998 Leer Vide Empty Für meine lieben Eltern und meine Freunde Leer Vide Empty Prot Dr G Folkers danke ich für die Möglichkeit, die Promotionsarbeit in seiner Gruppe durchfuhren zu dürfen Besonders danke ich PD Dr UE Spichiger, die es verstand, meine Arbeit durch zahlreiche anregende Diskussionen zu leiten Auch danke ich ihr für denunermüdlichen Einsatz zur Sicherstellung der finanziellen Unterstützung Ich danke Prof Dr U Wild lur die Übernahme des Korreferats Grosser Dank gebührt Prof Dr DJ Vonderschmitt, Dr P Pei und seinem Team vom Institut für klinische Chemie am Universitatsspital Zürich sowie Remo Wild für die Unterstützung wahrend des klinischen Teils dieser Arbeit Der OptikGruppe am PaulSchenerInstitut Zürich, besonders Dr RE Kunz, Dr HP Zappe und Bernd Maisenholder bin ich zu grossem Dank für die Ratschlage in physikalischen Belangen und Messungen verpflichtet Prof Dr G Patonay (Atlanta), Prof Dr OS Wolfbeis (Regensburg) und Dr Gerhard Mohr (Graz) danke ich für die zur Verfugung gestellten Farbstoffproben Den Laborkollegen Dr Stefan Räsonyi und Dr Luzi Jenny bin ich für ihre Unterstützung oder Durchfuhrung der Synthese und Strukturaufkla rungsarbeiten äusserst dankbar Für die statistische Beratung danke ich den Mitdoktoranden Caspar Demuth, Alphons Fakler und Mathias Nagele sowie Dr W Stahel vom Seminar für Statistik der ETH Für die sorgfal¬ tige Durchsicht des vorliegenden Texts danke ich Caspar Demuth und Thomas Roth, der mich auch bei Computerproblemen tatkraftig unter¬ stutzte Zum Schluss mochte ich allen heutigen und ehemaligen Gruppenmitghe dern für das offene und kameradschaftliche Klima in unserer Forschungs¬ gruppe danken, das das Arbeiten auch in schwierigen Phasen zu einer grossen Freude machte Leer Vide Empty Die folgenden Publikationen wurdenwahrend dieser Arbeit verfasst D Freiner, RE Kunz, D Citteno, UE Spichiger, M T Gale Integrated optical sensors based on refractometry of wn selective membranes, Sens Actuators B, 29, 277285 (1995) UE Spichiger, D Citteno, M Bott Analyteselective membranes and optical evaluatwn techniques Characterizatwn of response behavwur by ATR measurements, Proc SPIE, 2508, 179189 (1995) D Citteno, S Räsonyi, UE Spichiger Development of new dyes for use in integrated optical sensors, Fresenius J Anal Chem, 354, 836840 (1996) R Wild, D Citteno, JSpichiger, UE Spichiger Continuous momtonng of ethanol for bioprocess control by a chemical sensor, Journal of Biotechnology, 50, 3746 (1996) D Citteno, L Jenny, S Räsonyi, UE Spichiger Dyes for use in integrated optical sensors, Sens Actuators B, 39, 202206 (1997) GJ Mohr, D Citteno, UE Spichiger Synthesis of novel chromogenic hgandsfor optical sensing of ethanol, eingereicht zur Publikation (1997) D Citteno, M Nagele, W Stahel, P Pei, DJ Vonderschmitt, U E Spichiger Determination of the mass concentratwn of water, wmc strength and singleion activity coefficients in blood plasma of individual specimens, in Vorbereitung (1997) L Jenny, D Citteno, UE Spichiger Reduced dicyanovinyl dyes, in Vorbereitung (1998) Leer Vide Empty INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS 1 ZUSAMMENFASSUNG 13 2 SUMMARY 15 3 EINFUHRUNG 17 4CHEMISCHE SENSOREN IN DER MEDIZINISCHEN ANALYTIK 23 5 GRUNDLAGEN DER FUNKTIONSWEISE CHEMISCHER SENSOREN 27 51 Ionenselektive Elektroden27 52 Ionenselektive Optoden 32 6KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN 39 61 Einfuhrung in die Problemstellung 39 62 Menschliches Blut als Probenmatrix Fraktionierung 40 63 Abschätzung der Massenkonzentration von Wasser inPlasma 43 64 Abschätzung der EtnzehonenAktivitatskoeffizienten inPlasma 45 641 Das erweiterte DebyeHuckelModell 46 64 2 StokesRobinsonHydratationstheone 48 64 3 Das PitzerModell 49 644 Vergleich von Aküvitatskoeffizienten im physiologischen Bereich 52 65 Aktivitäten versus Konzentrationen 54 66 Umrechnung von Ionenaktivitaten inIonenkonzentrationen 57 661 Individuelle und mittlere Massenkonzentration von Wasser 62 66 2 Individuelle und mittlere molale Ionenstarke 64 663 Individuelle und mittlere molale Einzehonen Aktivitatskoeffizienten 66 664 Komplexierung von zweiwertigen Kationen 70 10 INHALTSVERZEICHNIS 665 Transformation von aktiven Molahtaten infreie (molare) Ionenkonzentrationen 73 67 Kalibration chemischer Sensoren für physiologische Proben 82 6 8 Abschätzung der Massenkonzentration von Wasser durch Vergleich von Ionenaktivitaten und Ionenkonzentrationen 84 69 Probenbedingte Variationen des Flussigkeitspotentials einer ISEMesskette 95 610 Direktmessungen mit optischen Sensoren 99 610 1 Einfluss des pHWertes auf die Messung mit optischen Sensoren 99 6 10 2 Vorversuche zur Messung der freien Ionenkonzentration in Vollblut 103 611 Schlussfolgerungen 105 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIRFARBSTOFFEN 109 71 Einfuhrung in die Problemstellung 109 72 Optische Eigenschaften von Molekülen 111 73 Chromoionophore für Optodenmembranen 114 74 NIR absorbierende Farbstoffe 119 741 Allgemeines 119 742 PolymethinFarbstoffe 120 75 Cyanine und Streptocyanine als Chromoionophore 124 751 Ausgangslage 124 75 2 Stabilität der Farbstoffe 127 753 Geeignete Membranmedien 129 754 pHempfindliche Optoden basierend auf NafionMembranen 130 755 Optoden basierend auf PVCMembranen 136 756 Schlussfolgerungen 138 INHALTSVERZEICHNIS 11 76 Merocyanine als Chromoionophore 140 761 Ausgangslage 140 762 pH empfindliche Optoden basierend aufweichgemachten PVC Membranen 143 763 Ca +selektive Optode für den Einsatz im NIR Spektralbereich 151 764 Schlussfolgerungen 157 77 Reduzierte Dicyanovinyl Farbstoffe 158 771 Ausgangslage 158 772 pH empfindliche Optoden basierend aufweichgemachten PVC Membranen 165 77 3 Ca'selektive Optode für den Einsatz im NIRSpektralbereich 177 774 Schlussfolgerungen 181 78 Das miniaturisierte Mach ZehnderInterferometer 182 8 AUSBLICK 187 9 EXPERIMENTELLER TEIL 189 91 Klinische Untersuchungen 189 911 Probanden 189 912 Probenahme 189 913 Verwendete Gerate und Methoden 190 914 Kahbrationsmethoden 192 915 Qualitätskontrolle 192 92 Zusammensetzung und Herstellung von Optodenmembranen 193 9 21 Optodenmembranen basierend auf PVC und OHPVC 193 9 2 2 Optodenmembranen aus Nafion 194 93 Messlosungen und Kahbratoren 195 94 Messgerate 196 95 Computersoftware und hardware 196 96 Verwendete Abkürzungen 197 12 INHALTSVERZEICHNIS 10 LITERATUR 201 Anhang 1 219 Anhang 2 225 Lebenslauf 235 13 1 Zusammenfassung Der erste Teil dieser Arbeit beschreibt die Rahmenbedingungen für den Einsatz von chemischen Sensoren für die Bestimmung von Elektro¬ lyten (Na+, K+, Ca1+, Mg1+) in Blutproben Die Resultate von direkten Messungen in unverdünnten Specimen wurden mit denjenigen von in¬ direkten Messungen in verdünnten Proben verglichen Das Probanden¬ kollektiv (n=82) setzte sich aus "Gesunden", sowie aus Hamodialysepati enten und Patienten der Intensivstation für innere Medizin zusammen Das Ziel der Studie war es, den Einfluss von Variationen der Massenkonzen¬ tration von Wasser, der Ionenstarke, der EinzehonenAktivitatskoeffizi enten und dem Komplexierungsgrad auf die Interpretation von Rohdaten zu untersuchen Diese Parameter sind verantwortlich für Differenzen zwi¬ schen den Resultaten aus indirekter und direkter Messung mit chemischen Sensoren Die IFCC (International Federation of Clinical Chemistry) empfiehlt einen Algorithmus, um Ergebnisse aus direkten ISEMessungen (lonenselektive Elektroden) rechnerisch in Gesamtkonzentrationen, äqui¬ valent zu Messwerten aus der indirekten Bestimmung, umzuwandeln Die Fehler, die durch die Anwendung dieses Algorithmus entstehen, wurden untersucht und diskutiert Für Na+ und K+ISEMessungen traten bei 17% und bei Ca2+ und Mg1+Analysen bei 37% der untersuchten Pati¬ entenproben Abweichungen vom "wahren" Wert von mehr als 05% auf Die Fehler rührten hauptsächlich von den interindividuellen Variationen der Massenkonzentration von Wasser her, die im IFCCAlgorithmus nicht berücksichtigt werden Die Datentransformation basierend auf diesem Al¬ gorithmus ist nicht nur gefahrlich in Bezug auf Fehlinterpretationen, sondern kann auch zum Verlust von wertvollen Informationen aus dem SensorRohsignal fuhren Zusätzliche Information, die Rückschlüsse auf die nicht direkt messbare Massenkonzentration von Wasser erlaubt, konnte aus dem Vergleich von direkter und indirekter Elektrolytmessung insbesondere von Natriumionen gewonnen werden 14 ZUSAMMENFASSUNG Im zweiten Ted der Arbeit ging es darum, pHIndikatoren, die sich für den Einsatz als Chromoionophore in monolithischintegrierten opti¬ schen Sensorsystemen eignen, zu entwickeln Das Ziel war es, die hohe Effizienz der Messplattform im roten und im nahen infraroten (NIR) Spektralbereich sowie billig verfugbare Laserdioden als Lichtquellen nut zen zu können Dies bedingte die optische Empfindlichkeit der Chromo¬ ionophore im NIRBereich Die kationischen Cyanin und Streptocyanin Farbstotfe zeigten Probleme in der Kombination mit den zur Verfügung stehenden neutralen, hpophilen Ionophoren in apolaren Membranmedien pHempfindliche NIROptoden mit dem polaren lonentauscherpolymer Nafion als Membranmatrix wurden realisiert Neutrale oder zwittenoni sche Merocyanine mit Absorptionsmaxima im Bereich von 800 nm führ¬ ten zu pHempfindlichen NIROptoden auf der Basis von weichgemachten PVCMembranen In Kombination mit dem Ionophor ETH 1001 war es möglich, eine Ca2+selektive Optode herzustellen, diebei pH 48einen dy¬ namischen Messbereich von 10 'bis 10 smol L'Ca2+ zeigte Reduzierte DicyanovinylFarbstoffe (ETHT 50035009), eine Klasse neu¬ artiger, neutraler Indikatoren, wurden isoliert und in weichgemachten PVCMembransystemen charakterisiert Diese Chromoionophore zeich¬ neten sich in der Optodenmembran durch eine ausserordentlich hohe chemische Stabilität gegenüber stark sauren oder stark alkalischen Medien sowie durch gute Loslichkeit aus Im deprotonierten, anionischen Zustand wurden breite Absorptionsbanden (emax 700012000 L mol 'cm"1) beob¬ achtet, deren Maxima in Abhängigkeit von Substituenten zwischen 600 und 760 nm lagen und die bis in den NIRBereich reichten Chemische Modifikationen zur Erhöhung der Aciditat der Indikatoren wurden vorge¬ nommen Die pKaWerte in der Membranphase lagen alle oberhalb von 70und waren teilweise hoher als 14 0, was eine genaue Bestimmung ver unmoghchte Eine Ca2+selektive Optode, die bei pH 27 einen dynami¬ schen Messbereich von 10"' bis 10"6 mol L"1 Ca2+ zeigte, wurde realisiert 15 2 Summary The hrst part ol the present work describes the conditions met when using chemical sensors to determine electrolytes in blood samples The results trom direct measurements in the undduted specimen were compared to the results from indirect measurements in diluted samples Electrolytes were analyzed in blood plasma samples from 82 volunteers The volunteers included "healthy" individuals as well as hospitahzed patients who were either from the intensive care unit or undergoing haemodialysis The aim of the study was to investigate the influence of vanations in the mass concentration of water, lonic strength, singleion activity coefficients and degree of complexation on the Interpretation of raw data These parameters may explain the differences between the re¬ sults obtained from indirect and direct measurements The IFCC (Inter¬ national Federation of Chnical Chemistry) recommends an algonthm in order to transform the results from direct ISE (tonselective electrodes) methods into total substance concentrations, corresponding to results from indirect ISE methods Errors resulting from the application of the algo¬ nthm were examined and discussed It was found that, when this algo¬ nthm was applied to the results of direct ISEanalysis, deviations from the "true" values of more than 05% occurred in 17% of the samples in which Na+ and K+ions were determined and in 37% of those tested for Ca2+ and Mg,+ions These errors were mainly due to individual differences in the mass concentration of water, which are not taken into consideration in the IFCCalgonthm It was concluded that the transformation procedure based on this algonthm isnot only dangerous with regard to possible mis mterpretations, but may also lead to the loss of important Information in¬ cluded in the "raw" sensor Signal Additional Information could be gained by companng direct and indirect electrolyte measurements, which allowed to estimate the mass concentration of water not directly accessible by other methods This method worked best with sodium 10ns 16 SUMMARY The aim of the second part of this work was to develop pH indicators suitable lor use as chromoionophores in monolithically integrated optical sensing Systems In order to be able to use the high efticiency of the measunng plattorm and lowcost diode lasers as light sources, the indicators had to be optically sensitive in the nearintrared (NIR) spectral ränge In atirst step, known polymethine dyes were studied With cyanine and streptocyanine dyes, there were problems com bintng cationic chromoionophores with neutral hpophilic lonophores in apolar membrane media pH sensitive NIRoptodes, based on the polar lonexchanger polymer Nafion where therelore developed The application of electncally neutral or zwittenonic merocyamnes allowed pH sensitive NIRoptodes to be produced in plasticized poly(vinyl chlonde) membranes (PVC) In combination with the Ca"+selective lonophore ETH 1001, a Ca+ selective NIRoptode with a dynamic measunng ränge from 10 'to 10 ^mol L'Ca,+ at pH 48was developed Reduced dicyanovinyl dyes (ETHT 5003 5009), anew cluss of neutral indicators were isolated and analyzed in plasticized PVC membranes These chromoionophores were extremely stable in both strongly acidic and strongly basic media as well as easily soluble In the deprotonated, anionic State, broad absorption bands (emax 7000 12000 Lmol 'cm ')with maxima in the ränge between 600 and 760 nm and reaching into the NIR spectral ränge were observed The spectral properties were dependent on the sidechain residues The indicators were chemically modified to in crease their acidity The pKa values in the membrane phase were higher than 70in all cases and higher then 14 0for some dyes, making itlm possible to determine an exact value A Ca'+selective NIRoptode with a dynamic measunng ränge between 10 'and 10 6mol L 'Ca,+ at pH 27 was developed 17 3 Einführung Ein Sensor ist ein abgegrenztes, miniaturisiertes Messsystem, das eine physikalische oder chemische Eigenschaft des zu vermessenden Mediums kontinuierlich in elektrische oder andere von einem Datenver¬ arbeitungssystem auswertbare Informationen, zB Lichtsignale, umwan¬ delt [1 2] Ein chemischer Sensor im speziellen ist ein Analyseinstrument, das in der Lage ist, Informationen über die chemischen Eigenschaften des den Sensor umgebenden Mediums zu liefern Diechemischen Parameter werden dabei in einer Probe selektiv, reversibel und kontinuierlich erfasst Reversibilität äussert sich in diesem Fall dann, dass Konzentra¬ tionsanderungen des Analyten nach oben und nach unten gemessen werden könnenund dass die Fähigkeit zur Signalerfassung nicht verloren geht Unter diese Definition fallen auch die Biosensoren, die sich dadurch abgrenzen, dass die Signalerkennung durch Enzyme oder Rezeptoren erfolgt Im Idealfall erfordert der Einsatz eines chemischen Sensors keine Probenvorbereitung und das erhaltene Messresultat hangt einzig von der zu bestimmenden Grosse ab Diese Tatsache macht denchemischen Sensor zum geeigneten Instrument für eine grosse Vielfalt von Anwendungen Vereinzelt werden auch analytische Werkzeuge, die einen chemischen Parameter zwar selektiv, aber irreversibel und daher nicht kontinuierlich erfassen können, den chemischen Sensoren zugerechnet In diese Klasse fallen zum Beispiel die meist irreversibel arbeitenden "Immunosensoren", die eigentlich keine echten Sensoren sind, da die Regenerierung der Anti korper in der Regel nur durch Waschvorgange erreicht werden kann Streng genommen sind diese vielmehr als sogenannte "Probes" zu be¬ zeichnen Auch Teststreifen zum Einweggebrauch oder Testrohrchen werden oft unberechtigterweise zu den chemischen Sensoren gezahlt Nicht immer ist es möglich, eine klare Grenze zwischen chemischen und physikalischen Sensoren zu ziehen Grundsätzlich kann der chemische 18 EINFUHRUNG Sensor auch als Erweiterung eines physikalischen Sensors betrachtet werden Schliesslich muss ein chemisches Signal in ein elektronisch mess¬ bares Signal umgewandelt werden, um eine chemischeGrosse quantitativ erfassen zu können Die Messung des generierten elektronischen Signals erfolgt dann in der Regel mittels eines physikalischen Sensors Dieser, als Signaltransduktion bezeichnete Vorgang, kann auf vielfaltige Art und Weise erfolgen Die am häufigsten angewandten Methoden sind die elektrische, die optische und die mechanische Transduktion über Beobachtung von Massenanderungen Bei der optischen Transduktion wird das chemische Signal in einem ersten Schritt in ein optisches Signal umgewandelt Je nach Auslegung des Signalwandlers wird dann das optischeSignal in einem zweiten Schritt als Absorption, Emission, optische Dispersion oder Reflexion gemessen, um nur einige Beispiele zu nennen Die Einfachheit der Handhabung chemischer Sensorsysteme, die relativ geringe Grosse und die Unabhängigkeit von Reagenzien ermöglichen eine rasche, mobile Analyse direkt vor Ort [3] Fernüberwachung gestattet den Einsatz in gefährdeten Bereichen oder eine kontinuierliche Überwachung auch über grossere Distanzen Auch in Fallen, in denen eine sehr rasche Entscheidung notwendig sein kann, wie zum Beispiel in derklinischmedi zinischen Analytik, kommen häufig chemische Sensoren zum Einsatz Die klinische Chemie ist einer der Bereiche, in dem die chemische Sensor¬ technik schon am tiefsten verwurzelt ist und am häufigsten eingesetzt wird [4] Sei es, dass chemische Sensorelemente als Bestandteile automatisierter Laborsysteme dienen (Messung von Blutelektrolyten) oder dass sie für die direkte Überwachung von Notfallpatienten auf der Intensivstation von Krankenhausern verwendet werden (Elektrolyte, pO,, pC02, pH) Der Einsatz chemischer Sensoren in der Mess und Regeltechnik nimmt an Bedeutung zu [5, 6] Die Prozesskontrolle und Steuerung durch die Kopplung eines Sensors an Dosierpumpen, Forderanlagen und Heizvor¬ richtungen in der industriellen Produktion ist zum Forschungsgegenstand EINFUHRUNG 19 auf dem Gebiet der Sensonk geworden [7] Chemische Sensoren können auch als Bestandteile von Warngeraten zum Einsatz kommen In diesem Fall steht nicht eine genaue Erfassung einer Analytkonzentration im Vordergrund sondern die Überwachung eines Grenzwertes Wird dieser überschritten, so muss ein Alarm ausgelost werden In die gleiche Richtung geht auch die Verwendung von chemischen Sensoren für ein vorgangiges Screening bei sehr hoher Anzahl anfallender Proben in einem analytischen Laboratorium In diesem Fall werden nur diejenigen Proben der detaillierten Laboranalyse zugeführt, deren Konzentration zuvor bei einer Messung mit einem Sensor einen kritischen Schwellenwert überschritten hat Dadurch wird ein grosser Anteil von garantiert negativen (true negative) Proben aussortiert Dies kann zu einer erheblichen Arbeitsentlastung eines Labors fuhren und dadurch garantieren, dass wirklich problematische Proben rascher erkannt werden und deshalb notwendige Gegenmassnahmen früher getroffen werden können Für die Evaluation der Qualltat eines chemischen Sensors sind gewisse Kenngrossen entscheidend Als wichtigste sind hier die Selektivität, die Sensitivitat, die Ansprechgeschwindigkeit und die Lebensdauer zu nennen Auf jeden Fall muss ein Sensor immer auf die bevorstehende Applikation hin ausgewählt und nötigenfalls angepasst werden Wahrend in gewissen Fallen beispielsweise eine hohe Lebensdauer wichtiger als eine hohe An Sprechgeschwindigkeit ist, kann es sich für eine andere Anwendung gerade umgekehrt verhalten Den AllzweckSensor für jede beliebige Anwendung wird es nicht geben, denn dies wäre kein optimierter Sensor Obwohl auf dem Gebiet der chemischen Sensoren schon seit Jahrzehnten intensiv gearbeitet wird, bleibt dieser Themenkreis für die wissen¬ schaftliche Forschung von grossem Interesse Die Forschung auf dem Gebiet der chemischen Sensoren lasst sich heute vereinfacht in zwei Sektoren einteilen Zum einen sind immer noch grosse Anstrengungen 20 EINFUHRUNG notwendig und auch im Gange, um neue, selektive Erkennungskompo¬ nenten für weitere Analyte zu entwickeln Zum anderen wird versucht, den im Laborsystem unter genau definierten Bedingungen bereits funktio¬ nierenden Sensor durch Anpassung an neue Messtechniken und an reale Gegebenheiten zur Marktreife zu bringen Dass kommerzialisierte che¬ mische Sensorsysteme auf dem Markt durchaus gute Chancen haben, kann aus denZahlen in den Tabellen 3la und 3lb entnommen werden, die auf Daten aus dem Jahr 1994 beruhen Über einen Zeitraum von 10 Jahren wird für die chemischen Sensoren ohne Einbezug der Biosensoren weit weit eine Marktsteigerung um einen Faktor 2bis 3prognostiziert Für die Biosensoren wird sogar eine Zunahme um einen Faktor 3bis 4voraus gesagt Tabelle 31 (a) Gegenwartiger und projektierter Weltmarkt für che¬ mische Sensoren (ohne Biosensoren) und (b) für Biosensoren (in Milli¬ onen USDollar) [8] 3la Marktsegment 1994 1999a 2004" Zuwachsb(%) Biomedizin 200 310 520 812 Umwelt/Arbeitsplatzuberwachung 250 420 760 1014 Industrieproduktion 50 70 100 68 Total 500 800 1380 911 EINFUHRUNG 21 3lb Marktsegment 1994 1999J 2004a Zuwachsb(%) Medi/in /Klinik 220 440 950 14 16 Industrieproduktion 75 120 250 10 12 Militär /Verteidigung 65 95 150 79 Umweltuberwachung 25 40 75 1012 Landwirtschaft /Vetennarwesen 10 15 35 1015 Andere 5 10 20 912 Total 400 720 1480 1015 aProjektiert im Jahr 1994 in US$, beinhaltet sowohl Verkauf, wie auch Vertrage in Forschung und Entwicklung bDurchschnittliche, jährliche Wachstumsrate Leider muss man aber feststellen, dass der Forschungssektor, der steh mit der messtechnischen Weiterentwicklung chemischer Sensoren befasst oft unterschätzt und dadurch vernachlässigt wird Anders hesse sich die doch recht beachtliche Diskrepanz zwischen der grossen Anzahl Veröffent¬ lichungen auf dem Gebiet der Liganden und Sensorentwicklung und der kleinen Anzahl der auf den Markt gebrachten chemischen Sensoren nicht erklaren Gerade bei den optischen Sensoren gibt es bis heute nur sehr wenige Gerate, die bereits im Handel erhaltlich sind, obwohl standig neue Publikationen zu diesem Thema abgedruckt werden Um den optischen Sensoren zu einem Durchbruch zu verhelfen, sollte vermehrt die Nutzung der modernen, physikalischen, optischen Messtechnik in die Sensor¬ entwicklung einbezogen werden Dazu ist interdisziplinäre Zusammen¬ arbeit notwendig Nur so lasst sich verhindern, dass die Entwicklung der optischen Sensoren immer hinter der neuesten Technologie zurückbleibt 22 EINFUHRUNG Diese Dissertationsarbeit wurde zu einem grossen Teil im Rahmen des nationalen Forschungsprogramms "OPTIQUE" (Projekt Nr 512) durchgeführt [9] Einerseits ging es darum, schon vorhandene Prinzipien auf dem Gebiet der chemischen Sensoren für die Anwendung in klinischen Blutproben zu untersuchen und im zweiten Ted dann schliesslich an die neuesten Entwicklungen im Bereich der optischen Messtechnik anzu passen, um dadurch einen Beitrag zu einer möglichen Kommer¬ zialisierung zu liefern Diese Arbeit ist also eher dem zweiten der oben genannten Forschungsschwerpunkte zuzuordnen 23 4 Chemische Sensoren in der medizinischen Analytik Der klinischmedizinische Bereich gehört zu den ersten Anwen¬ dungsgebieten der chemischen Sensonk Bereits im Jahre 1970 wurden lonenselektive Elektroden fürdie Elektrolytbestimmung in physiolo¬ gischen Proben eingesetzt [10] Heute sind sie aus den Labors nicht mehr wegzudenken Immunologische und enzymatische Testverfahren, obwohl keine Sensoren im engeren Sinne, sind sehr stark verbreitet und kommen zur Hauptsache bei der Bestimmung biologischer Substrate zum Einsatz Im Bereich der optischen Sensoren allerdings, sind bis heute nur in Aus¬ nahmefallen kommerziell erhältliche Gerate im klinischen Labor im Ein¬ satz Dies erstaunt um so mehr, als Farbreaktionen, oft gekoppelt mit en zymatischer Umsetzung eines Analyten, zu den meistverwendeten Bestim¬ mungsmethoden für klinische Analyte gehören und dadurch die optische Spektroskopie eine bekannte Methode in der klinischen Chemie darstellt Eine Erklärung mag mitunter der allgemeine Ruckstand der optischen Sensoren gegenüber den elektrochemischen Sensoren im Hinblick auf die Kommerzialisierung sein Besonders in grossen Spitalern werden heute sehr hohe Anforderungen an die medizinische Analytik gestellt Dies kann man beispielsweise aus Zahlen entnehmen, welche im Jahresbericht 1996 des Umversitatsspital Zürich veröffentlicht wurden [11] Die grosse Zahl der Laborauftrage verlangt weitgehend automatisierte und sehr rasche Methoden In Tabelle 41wird eine Übersicht über die zehn häufigsten, im Jahre 1996 im Umversitatsspital Zürich geleisteten Analysen gegeben Chemische Sensoren sind in der Regel nicht dazu gedacht und geeignet, das klinische Grosslabor mit automatisierten Analysesystemen zu ersetzten, jedoch aber sinnvoll zu erganzen Zum Teil sind chemische Sensoren auch als Bestandteile von Laborautomaten im Einsatz Die in 24 CHEMISCHESENSOREN IN DER MEDIZINISCHEN ANALYTIK Tabelle 41genannten Beispiele von Referenzen zeigen auf, dass für die Hälfte der am häufigsten verlangten Analyseparameter chemische Sensoren bereits heute zur Verfugung stehen und eingesetzt werden oder in der Entwicklung schon fortgeschritten sind Gerade für Notfall stationen, periphere Spitalabteilungen oder Arztpraxen konnte also der rasch zur Verfugung stehende und einfach handhabbare Sensor eine wün¬ schenswerte Alternative zum klinischen Zentrallabor darstellen Auch im Hinblick auf die kontinuierliche Zustandsuberwachung von Patienten in kritischen Situationen [12] bis hin zur mvivo Überwachung eines Ana lyten bietet der Sensor Möglichkeiten, welche die Laboranalytik nicht aul¬ weist Dies mögen bestimmt mit Grunde sein, weshalb in Tabelle 31der medizinische Bereich stets an erster Stelle bei den projektierten Umsätzen auf dem Weltmarkt steht Der Einsatz von chemischen Sensoren im medizinischen Bereich bietet sich aber nicht nur für stationäre Standorte wie Spitaler und Arztpraxen an Die Tatsache, dass für viele der in Tabelle 41aufgeführten Analyte die notfallmassige Analyse sehr häufig angefordert wird (für Kreatinin in 39% aller Falle, für Kalium in 46%, für Harnstoff in 52%) weist darauf hin, dass mobile Analysegerate für den Notfall und Katastropheneinsatz (z B in Ambulanzfahrzeugen) auf dem Markt gute Chancen haben CHEMISCHE SENSOREN IN DER MEDIZINISCHEN ANALYTIK 25 Tabelle 41 Die zehn am häufigsten verlangten Analyseparameter im klinischchemischen Labor des Umversitatsspital Zürich [11] und die an¬ gewandte Methode Analyt Anzahl Analysen (1996) Methode Sensor" Kreatinin 124000 Komplexbildung Optische Detektion [13, 14] Kalium 120000 ISE Flammenphotometne [15] Creaktives Protein 99500 Nephelometrie Natrium 88800 ISE Flammenphotometne [15, 16] Glucose 79100 Enzymatisch Optische Detektion [17] AlaninAminotransferase 78600 Enzymatisch AspartatAminotransferase 75800 Enzymatisch Optische Detektion Prothrombinzeit 65900 Optische Detektion Alkalische Phosphatase 64500 Enzymatisch Optische Detektion Harnstoff 61200 Enzymatisch Optische Detektion [18, 19] aAusgewählte Beispiele von Referenzen zu Entwicklungen oder Anwen¬ dungen von chemischen Sensoren auf dem entsprechenden Gebiet 26 CHEMISCHESENSOREN IN DER MEDIZINISCHEN ANALYTIK Es stellt sich die Frage, weshalb gerade chemische Sensoren basierend auf optischer Transduktion für den medizinischen Einsatzentwickelt werden sollen, obwohl sich die elektrochemischen Analoga schon längere Zeit bewahrt haben [20, 21] Ein wichtiger Grund ist mit Sicherheit der grosse technische Fortschritt und das hohe Entwicklungspotential im Bereich dei optischen Messtechnik Dies fuhrt zu einer Auswahl an hoch¬ empfindlichen, miniaturisierbaren Messplattformen, die den Bedurfnissen angepasst werdenkönnen Ein weiterer Vorzug der optischen Sensoren hegt in der Vielfalt der möglichen Messtechniken [22] Je nach Aufbau des Sensorsystems kann die Signaldetektion im Absorptions, im Fluoreszenz¬ oder im Dispersionsmodus erfolgen (vgl Abschnitte 52, 72und 78) In der Regel stehen mehrere der genannten Möglichkeiten simultan zur Verfugung Neben dem hohen Potential zur Miniaturisierung und zur kostengünstigen Serienproduktion ist im klinischen Sektor aber auch die Störanfälligkeit des gemessenen Signals von zentraler Bedeutung Wird der Sensor im Umfeld elektrischer Gerate oder für denmobilen Einsatz verwendet, muss für elektrochemische Sensorsysteme gegen die allgegen¬ wärtigen elektrischen Felder abgeschirmt werden, im Gegensatz zu optischen Systemen Bei invasiven mvivo Messungen muss zusatzlich die Sicherheit des Patienten bedacht werden Auch in diesem Bereich sind optische Systeme den elektrochemischen vorzuziehen, da kein direkter elektrischer Kontakt zwischen dem Patienten und dem Messgerat besteht 27 5 Grundlagen der Funktionsweise chemischerSensoren Weil in dieser Arbeit hauptsachlich auf dem Gebiet der Elektrolyt Analyse gearbeitet wurde, sind in den folgenden zwei Unterkapiteln die Grundlagen zum Verständnis der Funktionsweise von lonenselektiven Sensoren zusammengestellt Dabei werden die beiden wichtigsten Kate¬ gorien von Sensoren fürdie Ionenanalytik behandelt die potentiome tnschen Sensoren lonenselektive Elektroden (ISE) und die optischen Sensoren lonenselektive Optoden In beiden Fallen wird für detail¬ liertere Ausführungen auf die entsprechende Fachliteratur verwiesen und lediglich auf diefür das Verständnis der vorliegenden Arbeit zentralen Sachverhalte eingegangen 51 Ionenselektive Elektroden Im Falle der lonenselektiven Elektroden (ISE) erfolgt die Trans¬ duktion der chemischen Erkennung über ein Potential Eine lonenselektive MembranelektrodenMesskette besteht aus zwei galvanischen Halbzellen, die über ein hochohmiges Voltmeter miteinander verbunden sind Die eine Halbzelle setzt sich aus der lonenselektiven Membran, dem Innen ableitelektrolyten und der Innenableitung zusammen, wahrend die zweite Halbzelle aus einer Referenzelektrode (z B einer Kalomelelektrode) besteht Ein schematischer Aufbau ist in Abbildung 51gegeben 28 GRUNDLAGEN DER FUNKTIONSWEISE CHEMISCHERSENSOREN Referenz Ag/AgCI Innenableitung Innenableit elektrolyt lonenselektive Membran Kalomel (Hg/Hg2CI2) KCl gesattigt Diaphragma Brucken elektrolyt Kapillare Abb 51: Schematische Darstellung einer potentiometrischen Messzelle Im Idealfall besteht in einer derartigen Messkette eine direkte Ab¬ hängigkeit zwischen der Aktivität des zu messenden Ions und dem Potential Das Potential, auch als elektromotorische Kraft (EMK) bezeich¬ net, setzt sich aus der Summe der an allen Phasengrenzen und Kontakt¬ stellen auftretenden Potentialdifferenzen E, zusammen: Hg Hg2Cl2 KCl iBrücken Pr obe¬ res); elektrolyt;| lösung Membran Innenableit elektrolyt AgCl Ag y E2 £, Es E< I Referenzelektrode ISE 51lonenselektive Elektroden 29 Die experimentellen Bedingungen werden derart gewählt, dass über die Messkette kein Strom fliesst (hohe Widerstände) In diesem Fall hegt ein elektrochemisches Gleichgewicht vor, und die gemessene EMK entspricht der Gleichgewichtszellspannung EMK =£,+£, +£,+ E, +EM +E4 +£, (5 1) mit EMK Gesamtpotential [V] £,, £„ £, Messgutunabhangige Potentiale in der Referenz elektrode [V] Ej Messgutabhangiges Flussigkeitspotential (liquid junction potential) [V] EM Messgutabhangiges Membranpotential [V] £4, £, Messgutunabhangige Potentiale in der Innenableitung [V] Alle messgutunabhangigen und demzufolge für ein gegebenes System konstanten Potentialbeitrage E, bis E, werden durch den Ausdruck £° zusammengefasst Gleichung 51reduziert sich damit zu EMK =£° +E, +EM (5 2) Wird vom Beitrag des Flussigkeitspotentials E, abgesehen, entspricht die gemessene EMK dem Membranpotential EM und ist somit für das lonenselektive Verhalten der Membran charakteristisch Die Abhängigkeit des Messsignals von der Aktivität des Messions wird durch die Nernstsche Gleichung beschrieben 30 GRUNDLAGEN DER FUNKTIONSWEISE CHEMISCHER SENSOREN EMK =E° +s loga, (5 3) mit £° Standardpotential der Messkette [V] s Nernstsche Steigung der Elektrodenfunktion [V] a, Aktivität des Messions in der Probelosung [1] Als weitere messgutabhangige Grosse bleibt noch das Flussigkeitspotential £j, das im Messsignal nach Gleichung 53 mitenthalten ist Es stellt sich auf Grund der verschiedenen Mobilitäten von Kationen und Anionen in der als Bruckenelektrolyt gewählten Losung ein Die Ionen der konzen¬ trierten Elektrolytlosung in der Brücke diffundieren in die Messlosung und verursachen dadurch ein Diffusionspotential Die Brücke hat die Funktion, das Messgut in Kontakt mit der Referenzelektrode (Kalomel) zu bringen Der Betrag von Es lasst sich durch Wahl eines aquitransferenten Elektrolyten (gleiche Mobilität von Anionen und Kationen) hoher Konzentration als Brücke minimieren Wegen der standigen Diffusion ins Messgut muss aber die Kontamination der Probelosung beachtet werden Aus diesem Grund hat sich für klinische Anwendungen eine 1mol L"1 KahumchlondLosung als Kompromisslosung bewahrt Eine Möglichkeit zur Berechnung des Flussigkeitspotentials bei bekannter Probenzusammensetzung gibt die Gleichung von Henderson, die einen linearen Verlauf der Aktivitatsprofile in der Diffusionsgrenzschicht postuliert 51lonenselektive Elektroden 31 X?, u \a a \ Hz, u a 1 1\1 1I nr 1 1 __J ül_ lnJ JJ r 2 l *\ F v 2 Xz h [a a j r IZj "j ß £t=^ : iT^ln^ ^ (54) mit c, Ladung desIons I h, Absolute Beweglichkeit des Ions I[cm2 s'J'mol] R Universelle Gaskonstante (R= 8314 JK 'mol ') T Absolute Temperatur [K] F FaradayKonstante (F= 96487 Cmol ') ^ Summe über alle Ionen der Probelosung und des i Bruckenelektrolyten a, Aktivität des Ions Iin der Probelosung a, Aktivität des Ions Iim Bruckenelektrolyten Für die praktische Auswertung sollte die gemessene EMK um den Wert des Flussigkeitspotentials (EMK £,) korrigiert werden (vgl Kapitel 69) oder bei der Kalibration der Elektrode mitberucksichtigt werden (vgl Kapitel 67) Auf detaillierte Ausfuhrungen wird an dieser Stelle verzichtet Es sei aber auf wichtige Literatur zum Thema der Membranmodelle und Selek¬ tivitäten für lonenselektive Elektroden verwiesen [2329] 32 GRUNDLAGEN DER FUNKTIONSWEISE CHEMISCHERSENSOREN 52 Ionenselektive Optoden Wie in Kapitel 3erwähnt, erfolgt im Falle der optischen Sensoren eine Transduktion des chemischen Signals in eine optisch erfassbare Messgrosse Die wahrend dieser Arbeit untersuchten optischen Sensoren beruhen alle auf einem aktiven Massentransport des zu untersuchenden Analyten aus der wassngen Probelosung in eine lipophile, organische Schicht (Membran), die aus einem weichgemachten Polymer als Matrix besteht Bei diesem Vorgang stellt sich ein thermodynamisches Gleich¬ gewicht zwischen der Probelosung und der gesamten, homogenen Sensor¬ schicht ein Derartige Membranschichten werden als Bulkoptoden be¬ zeichnet und stehen im Gegensatz zu oberflächenaktiven Systemen Das Ausmass des Massentransportes wird durch die in die Membran einge¬ brachten Erkennungskomponenten und Hilfsstoffe bestimmt In vielen Fallen erfolgt die Extraktion des Analyten in die organische Phase durch Komplexbildung mit einem Liganden L oder durch eine selektive, reversible chemische Reaktion (in der Regel für neutrale Analyte) Eine ausführliche Übersicht über die zugrundeliegenden Phasentransfergleich gewichte, über verschiedene Realisierungsmoglichkeiten derartiger Systeme und die Herleitung der zugehörigen Gleichungen findetsich bei Bakker et al [30, 31] An dieser Stelle werden lediglich die Grundlagen zum Verständnis eines kationenselektiven Optodensystems diskutiert Eine schematische Darstellung einer kationenselektiven Membran findet man in Abbildung 52 Der zugesetzte Chromoionophor C, ein hpophihsierter pHIndikator, ist für die Transduktion des chemischen Signals in eine optisch messbare Grosse verantwortlich Die Änderung der optischen Eigenschaften des Membransystems kommt durch den Austausch von Protonen H+ gegen Analytkationen I+ und der damit verbundenen Proto merung resp Deprotomerung des Indikators zustande Zur Aufrecht¬ erhaltung der Elektroneutrahtat ist in manchen Fallen der Zusatz von membranloshchen, hpophden ionischen Komponenten R+ oder R" 52lonenselektive Optoden 33 notwendig Als anionischer Zusatz wird in der Regel ein hpophiles Borat¬ salz und als kationischer Zusatz ein hpophiles Ammoniumsalz eingesetzt (a)(b) hf IL+ L CH C Abb 52 Schematische Darstellungen einer kationenselektiven Bulk optode (a) mit neutralem Liganden Lund neutralem Chromoionophor C, (b) mit neutralem Liganden L und (m deprotoniertem) Zustand geladenem Chromoionophor C , I+ Analyt Kation, R hpophder, anionischer Zusatz Für den einfachsten Fall eines Kationenaustauschsystems ohne Zusatz eines selektiven Liganden lasst sich das folgende Gleichgewicht zwischen der Probelosung und der Optodenmembran formulieren F+(aq) +vCH+(mem) « Iv+(mem) +vC(mem) +vH+(aq) (5 5) Vbezeichnet die Ladungszahl des Kations Die Austauschkonstante lautet für diesen Fall K =K exch chrom :*H (*)" = (5 6) 34 GRUNDLAGEN DER FUNKTIONSWEISE CHEMISCHER SENSOREN Aktivitäten beziehen sich auf Spezies in der Wasserphase Die eckigen Klammern bezeichnen Konzentrationen in der organischen Membranphase unter der Annahme, dass die Aktivitatskoeffizienten konstant bleiben Die Konstante KH, bezeichnet das Austauschgleichgewicht zwischen Protonen und AnalytKationen und ist durch die Verteilung der beiden Ionen zwischen der wassngen und der organischen Phase bestimmt K^ be zeichnet die Aciditatskonstante des Chromoionophors in der Membran¬ phase Die Beziehung 56lasst sich zur experimentellen Bestimmung von Aciditaten der Chromoionophore in der Membranphase ausnutzen [32] Wird ein kationenselektiver Liganden L in die Optodenmembran eingebracht, verändert sich Gleichung 55 zu r+(aq)+pL(mem)+vCH+(mem) « ILp+(mem)+vC(mem)+vH+(aq) (5 7) Der Index pgibt die Stochiometne des Komplexes zwischen dem Mession Iv+ und dem Liganden Lan In Analogie zu Gleichung 56formuliert man die Austauschkonstante m _(v)"f [clVK'1 ^exih ör+ [OT] (5 8) [L]P welche auch geschrieben werden kann als tfexcPh=*H1 ßir (*)" (5 9) mit der Bruttostabihtatskonstante ßlL des Komplexes ILp+ in der Membranphase Aus dem optischen Messsignal kann auf das Konzen trationsverhaltnis zwischen protomertem und gesamten Chromoionophor 52lonenselektive Optoden 35 in der Membran, den Protonierungsgrad 1a geschlossen werden Dieser wird mit der gewünschten Messgrosse der Analytaktivitat av+ in Ver¬ bindung gebracht (siehe Gleichung 514) Als zusätzliche Parameter stehen die aus der Membranherstellung bekanntenGrossen wie die Kon¬ zentration an Ligand LT und an Chromoionophor CT mit ihren Massen bilanzen sowie an anionischem Additiv RT mit der Elektroneutrahtatsbe dingung zur Verfugung LT=[L]10lj,=[L] +p [IL;+] (5 10) CT=[C]toldl=[C] +[CH +] (5 11) Rt=[R"L=[CH+] +MILVp1 <512) Der Protonierungsgrad 1a lasst sich nun direkt aus dem Messsignal be¬ stimmen, wie hier am Beispiel der Extinktionsmessung gezeigt wird Das gleiche Prinzip lasst sich aber beispielsweise auch auf die Fluoreszenz¬ emissionsmessung [33 34] oder Brechungsindexmessung [35] anwenden ,„JSl A~A^ (513, C A —A ^T ^prot "deprot mit A Extinktion der Membranschicht bei einem beliebigen Gleichgewichtszustand Aprol, Adtpro, Extinktion der Membranschicht bei vollständig protomertem bzw deprotoniertem Chromoinophor 36 GRUNDLAGEN DER FUNKTIONSWEISE CHEMISCHER SENSOREN Aus Kombination von Gleichungen 58 und 5105 13 erhalt man für die Aktivität des Analyten v, (vl f«_y —»toic,— (514, * ll°J v(LT£{RT(a)CT})' Auf ahnliche Weise erhalt man für eine Optode mit einem negativ ge¬ ladenen Chromoionophor C (Abb 52b), die ohne den Zusatz eines anionischen Additivs R auskommt, die untenstehende Beziehung „ =ivL { ' )' —?£i (515) 1 «£i ld«)cTJ ,(LT_£aCT)' Aus Gleichungen 514 und 515 geht klar hervor, dass eine auf Ionen austausch basierende Optode nicht allein auf die Metalhonenaktivitat a„t, sondern vielmehr auf das Verhältnis der Aktivitäten des Mess und Referenzions (in diesem Fall der Protonen) anspricht Für den Einsatz der Optode bedeutet das, dass die Referenzionenaktivitat, dh der pHWert, entweder simultan miterfasst oder durch Pufferung der Probelosung konstant gehalten werden muss Es lasst sich berechnen [30], dass pH Anderungen von 001Einheiten bei der Erfassung von zweiwertigen Kationen das Analysenresultat bereits um 45% verfalschen Steigt der pHWert der Probe um 001 Einheiten an, sinkt die Messionenaktiv itat eines zweiwertigen Kations vermeintlich um 45 % Für einwertige Kationen ist der Fehlerbeitrag halb so gross Auf die Konsequenzen dieser Tatsache in Bezug auf klinische Messungen wird in Kapitel 610 eingegangen 52lonenselektive Optoden 37 In Gleichungen 514 und 515 wird der Einfluss von in der Probelosung auftretenden Stononen nicht berücksichtigt In Analogie zu den poten tiometnschen Sensoren lasst sich ein optischer Selektivitatskoeffizient Ar,°pt definieren An dieser Stelle soll aber nur auf die Arbeiten von Bakker und Simon [31] sowie von Lerchi et al [36] verwiesen werden, die eine detail¬ lierte Einfuhrung liefern 38 39 6 Klinische Ionenanalytik mit chemischen Sensoren 61 Einfuhrung in die Problemstellung Um die maximale Leistung eines chemischen Sensorsystems nutzen zu können, ist es von Vorteil, den Sensor auf die zu analysierende Probe anzupassen und zu optimieren Dazu ist die Kenntnis möglichst vieler Rahmenbedingungen eine wichtige Voraussetzung Ferner ist die Ver¬ arbeitung des Rohsignals in eine klinisch sinnvolle und interpretierbare Grosse notwendig, um das System für den Anwender attraktiv zu machen Schliesslich sollte in einem vollständigen Analysensystem auch die für die Kalibration und Datenauswertung benotigte Software integriert sein Das Ziel im klinischen Ted der vorliegenden Arbeit war es, im Hinblick auf die oben aufgeführten Gesichtspunkte Möglichkeiten, Bedingungen und Grenzen für den Direkteinsatz von potentiometnschen und optischen Sensoren in der unverdünnten Probe in der Regel Vollblut, Plasma oder Serum zu untersuchen Es stellte sich unter anderem die Frage, inwiefern die heute gangige Praxis der Verarbeitung des Rohsignals eines Sensors Unsicherheiten [37] birgt und wie sich diese eliminieren lassen Besonders wurde das Problem des Vergleichs von Aktivitäts und Gesamt konzentrationsmessungen durch eine Datenvahdierung mit realen Proben aus dem Spitalbetrieb genauer beleuchtet Im Zentrum stand in diesem Zusammenhang die Massenkonzentration von Wasser Diese Grosse be¬ rücksichtigt, dass Vollblut, Plasma oder Serum nicht allein aus einem wassngen Anteil bestehen Gleichzeitig ging es darum abzuklären, welche Faktoren beim Einsatz chemischer Sensoren mögliche Fehlerquellen für verfälschte Resultate darstellen und in welcher Grossenordnung die daraus resultierenden Fehler liegen Von Interesse waren vor allem Parameter, die aufgrund 40 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN der angewandten Messtechnik eine direkte Auswirkung auf das Rohsignal des chemischen Sensors ausüben Dazu zahlen das Flussigkeitspotential bei der Verwendung von ISE und der pHWert beim Einsatz lonenselektiver Austauschoptoden Mit der zur Verfügung stehenden Infrastruktur eines grossen Routine spitallabors erfolgte die simultane Messung des pHWertes, der Protein, Lipid, Harnstoff und Glucosekonzentration sowie der Elektrolyt¬ konzentrationen in Plasmaproben Durch lonenselektive Messungen der freien Elektrolytkonzentrationen konnten Rückschlüsse auf die Ionen aktivitaten gemacht werden Die gesammelten Daten wurden aufgrund von bekannten mathematischen Modellen ausgewertet und auf die be¬ trachteten Sensorsysteme angewendet Die analysierten Proben stammten von gesunden Testpersonen und von Spitalpatienten mit zwei ver schiedenen Krankheitsdiagnosen (Patienten mit Nierenversagen und Herz Kreislaufbeschwerden) Die beiden Gruppen wurden ausgewählt, weil für diese Patienten aus medizinischer Sicht die lonenanalytik und damit der Einsatz chemischer Sensoren besonders relevant ist 62 Menschliches Blut als Probenmatrix: Fraktionierung In menschlichem Vollblut beanspruchen die Blutzellen etwa 44 Prozent des gesamten Volumens Die übrigen 56 Prozent machen das Blutplasma aus Dann tragt die wassnge Phase ungefähr 93 % zum Gesamtvolumen bei Etwa 53% nehmen die Proteine ein, 062 % Lipide und 09% Trockensubstanz wie geloste Salze und Zucker [38] In Ab¬ hängigkeit von den physikochemischen Eigenschaften eines Analyten hegt dieser zwischen der Protein/Lipidphase und der wassngen Phase verteilt vor Die angewandte analytische Methode bestimmt, welche Fraktion quantifiziert wird Da chemische Sensoren am häufigsten für Elektrolyt 62 Menschliches Blut als Probenmatrix Fraktionierung 41 messungen eingesetzt werden, wird dies am Beispiel der Ionenanalytik erläutert Im folgenden sollen vier Fraktionen näher beleuchtet werden [39, 40]: 1 Die totale (molare) Substanzkonzentration c*obe des Ions jund des Individuums i im gesamten Probevolumen yProbc> ausgedrückt in mol •Lp'r„(,,,', bestimmt durch indirekte Potentiometrie (dh in der verdünnten Probe) mit ISEs oder mit herkömmlichen, photometrischen Methoden 2 Die (molare) Substanzkonzentration c^'' oder die Molalität matJ'f des freien Elektrolyten in der Wasserphase F,aq, ausgedrückt in mol •L"H'i0 (Molarität), beziehungsweise in mol •kg^o (Molalität) Diese Fraktion wird typischerweise durch direkte Potentiometrie mit ISEs in der unverdünnten Probe erfasst Die Voraussetzung ist, dass eine adäquate Kalibrationsmethode zur Verfügung steht Probleme, welche bei der Kalibration auftreten können, weiden in Abschnitt 67 behandelt 3 Die aktive Molalität2 des freien Elektrolyten in der Wasserphase m,aj', ausgedrückt in molkgH'i0 Dies ist die physikalische Grösse, welche von einer ionenselektiven Elektrode oder Optode direkt erfasst wird Die Beziehung zwischen der aktiven Molalität fh^' und der Molalität mld'J,t wird beschrieben durch einen Proportionalitätsfaktor, den molalen EinzelionenAktivitätskoeffizienten y für ein Ion jund ein Individuum i In Analogie dazu definiert man die aktive Konzentration 1Um Verwechslungen vorzubeugen werden innerhalb des Kapitels 6die physikalischen Einheiten mit Indices versehen, welche das Bezugssystem angeben (zB Probe Gesamte, physiologische Probe wie Serum, Plasma oder Vollblut, H:0 wassriger Anteil des physiologischen Untersuchungsgutes oder wassnge Losung) 2Diese Grosse istnahe verwandt mit der dimensionslosen relativen, molalen Aktivität des Elektrolyten a,! Der Zusammenhang zwischen den beiden Grossen ist gegeben durch aM =m,*l1l/m" (mit m" =1mol kgH'()) 42 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN des freien Elektrolyten in der Wasserphase C*q', ausgedruckt in mol L^q und denmolaren EinzehonenAktivitatskoeffizienten \M 4 Die (molare) Substanzkonzentration des freien Elektrolyten t]ProbLl im gesamten Probevolumen VProbc, ausgedruckt in mol Lp'robL Diese Fraktion ist in der klinischen Analytik routinemassig nicht dnekt zuganglich Ihre Bestimmung erfordert die Kenntnis der Massen¬ konzentration von Wasser p,Hl°, die den Massenanteil von Wasser im gesamten Probevolumen in kgH^0 Lp'robe beschreibt Für Elektrolyte mit einem sehr kleinen Anteil an komplex gebundenen Ionen, entspricht diese Fraktion aber naherungsweise der totalen (molaren) Substanz¬ konzentration c,Probe, die mit klinischer Routineanalytik zuganglich ist Die Diskriminierung zwischen den verschiedenen Fraktionen ist für die klinische Dateninterpretation von hoher Wichtigkeit Sie gibt Anlass zu Kontroversen und Fehldiagnosen (Pseudohyponatraemie scheinbar er¬ niedrigte Natriumionenkonzentration), seit Waugh 1969 seinen ersten Artikel über die Verdrängung von Wasser durch Proteine und Lipide in Humanserum und plasma veröffentlichte [41] Für diagnostische Zwecke wurde die Unterscheidung zwischen den zwei Fraktionen freie (molare) Ionenkonzentration in der Wasserphase c,a(jf und der totalen (molaren) Ionenkonzentration im gesamten Probevolumen c,Probe zur Routine Die biologische Aktivität von Elektrolyten wie Natrium, Kalium, Calcium oder Magnesium aber auch von Anionen wird am besten durch die aktive Molalitat m^' beschrieben Dennoch konnte sich bis heute die Grosse der aktiven Molalität in den klinischen Laboratorien wegen der Gefahr von Verwechslungen mit anderen Grossen nicht durchsetzten 63Abschätzung der Massenkonzentration von Wasser inPlasma 43 63 Abschätzung der Massenkonzentration von Wasser in Plasma Der Gehalt an Wasser in einer Plasma oder Serumprobe wird als Massenkonzentration von Wasser p ' bezeichnet und normalerweise in der Einheit kgH;0 LP'rohL angegeben p ' leitet sich aus dem Produkt derDichte von reinem Wasser p*H"° und dem Volumenverhaltnis des wassngen Anteils der Probe Vj"1 gegenüber dem Gesamtvolumen yProbe ab H,0 *H,0 v, ,s ,N Für die klinische Analytik mit chemischen Sensoren ist diese Grosse relevant, da mit Sensoren dieaktive Molalität m^ einer Substanz in der Wasserphase erfasst wird Die Massenkonzentration von Wasser ist routinemassig keine direkt zugangliche Messgrosse Sie muss über Um¬ wege bestimmt werden Eine Übersicht über verschiedene Verfahren findet man in [42] Eine klassische und sehr direkte Methode ist die gravimetrische Bestimmung des Wasseranteils durch Verdampfung bei 100 °C wahrend mindestens 24 Stunden Wegen der langen Analysedauer ist dieses Verfahren für die klinische Laboranwendung nicht geeignet Ein wesentlich rascheres, aber immer noch relativ aufwendiges Verfahren ist die gravimetrische Wasserbestimmung durch Verdampfung bei Mikro¬ wellenbestrahlung Diese Methode wurde als mögliche Referenzmethode vorgeschlagen [43] Ein anderes Vorgehen basiert auf der Messung der Osmolalitat über Gefrierpunktserniedrigung bei Verdünnung der Probe mit einer definierten Menge an Wasser [42] Experimentelle Unsicherheiten in der Osmolalitatsmessung und beim Verdünnen der Probe reduzieren aber die Zuverlässigkeit der Resultate 44 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN Eine gut etablierte und relativ rasche Methode ist die Abschätzung aus experimentellen Bestimmungen von Protein und Lipidkonzentrattonen Zwar stellten Faye und Payne bei einer Methodenevaluation fest, dass die Massenkonzentration von Wasser dabei systematisch leicht untei schätzt wurde, da nach der Zugabe einer bekannten Wassermenge nur eine Wiederfindungsrate von 99 01 % ermittelt wurde [42] Auf der anderen Seite wies diese Methode mit nur 02 % die geringste analytische Un Sicherheit innerhalb einer Messserie auf Da es fürdie vorliegende Arbeit wichtig war, klinische Variationen der Massenkonzentration von Wasser aufzuzeigen, wurde diese Methode wegen der hohen analytischen Präzision ausgewählt Das Verfahren basiert auf dem Effekt, dass Proteine und Lipide einen Teil des Plasmavolumens einnehmen und somit Wasser verdrangen Über die bekannte Dichte von Proteinen und Lipiden lasst sich das verdrängte Volumen abschätzen und somit auf die Massenkonzentration von Wasser zuruckschhessen Neben Proteinen und Lipiden finden sich in Plasma noch weitere Komponenten (Salze, organische Substanzen), die in dieser Approximation lediglich mit einem konstanten Term berücksichtigt werden P,H°[kgH0 lpLJ =ph,° ( Protein Lipid ^ 0991 *Protein Lipid (6 2) mit p* '[kg L_l 1 Dichte von Wasser p*Prolcin,p L,pkl[kg L"1] Mittlere Dichte der PlasmaProteinfraktion resp Lipidfraktion p,Prolun, p,L'p,d[kg Lp'robel Gemessene Massenkonzentration von Proteinen resp Lipiden Der konstante Term, 0991 LHi0 Lp'robe ,repräsentiert die Menge an Wasser in IL Probe, reduziert um das Volumen von Trockensubstanzen 64Abschätzung dei Em/elionenAkttvitatskoettizienten inPlasma 45 64 Abschätzung der EinzelionenAktivitätskoeffizienten in Plasma Der physikalischchemische Zusammenhang zwischen einer Kon zentrationsgrosse und einer Aktivitatsgrosse, ist durch den Aktivitats koettizienten yu beziehungsweise \,gegeben Gleichungen 63 und 64 zeigen diese Beziehung auf ><]<=Yn m/V (6 3) Diese Koeffizienten lassen sich experimentell, beispielsweise über eine Messung der Dampfdruckermerdrigung, ermitteln Im Falle von Elektrolyten aber sind die Einzehonen Aktivitatskoeffizienten y+l tund v+l für Kationen, respektive y,xund v,xfür Anionen, experimentell nicht direkt zuganglich [44] Mittels verschiedener Naherungsverfahren, die auf thermodynamischen Gesetzen beruhen, lassen sich aber die mittleren Aktivitatskoeffizienten y± und k auf der Basis von experimentell gemessenen Parametern abschätzen Für die anschliessende Aufspaltung in die EinzelionenAktivitatskoeffizienten sind aber nichtthermodynamische Annahmen notig Für Losungen eines einzelnen Elektrolyten existieien verschiedene, einfache Konventionen Einige davon sind durch Morf [24] zusammengefasst worden Die Behandlung von Losungen mit mehreren Elektrolyten ist komplexer als diejenige für reine Elektrolyte Oft wird angenommen, dass die EinzehonenAktivitatskoeffizienten in gemischten Elektrolytlosungen die gleichen Werte annehmen wie in reinen Elektro¬ lytlosungen der gleichen Ionenstarke wie die Mischlosung [45] Dabei werden also Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Ionen gleicher Ladung vernachlässigt Um möglichst zuverlässige Abschatzungen für die EinzehonenAktivitatskoeffizienten in Blut, Plasma oder Serum zu 46 KLINISCHE IONENANALY TIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN erhalten, verwendet man mit Vorteil eine Methode, welche die Besonderheiten von gemischten Elektrolytlosungen berücksichtigt 641Das erweiterte Debye HuckelModell Die von Debye und Huckel abgeleitete Näherung für die Ab¬ schätzung von mittleren Aktivitatskoeffizienten basiert hauptsachlich auf interionischen Wechselwirkungen unter der Annahme punktförmiger La¬ dungen Das Modell wurde erweitert, um die individuelle Ionengrosse zu berücksichtigen und schliesslich mit einem empirischen Term, der abhangig von der Ionenstarke ist, ergänzt [46, 47] Ia Jimolli logy±= r+~' 'V +C/m°'jl (6 5) l+BmaV7" _|7 7U Jjmolir log v+ = '+ ' V +C/molar (6 6) l+B,aV/molar mit z+, z Ladung des Kations bzw Anions Am, At / Losungsmittelspezifische Parameter (für Wasser bei 37 °C Bm, Bu gilt Am= 05193 kg"2mol"2 und At = 05211 L^mol""1 resp Bm =03301 10 '"m1 kg"2 mol "2und Bt = 0331210'" m"2morl/2) / Ionenstarke auf molaler [mol kg"1] bzw molarer [molL1] Basis (siehe Gleichung 67a /b) a Ionengrossenparameter [10"'° m] (siehe [48]) C Elektrolytspezifischer Parameter (siehe [48]) 64Abschätzung der Etnzelionen Aktivitatskoeffizienten inPlasma 47 Die Ionenstarke /für ein Ion jwird berechnet nach Gleichung 67 rmolar ' V^ Probt 1 2 /( ,\ / = 2,ci :i (67a) z i I i cProbU z2 7 =; 1»V ?j =r 1—hTö— (67b> z j z j P Aus den mittleren Aktivitatskoeffizienten erhalt man die Einzehonen Aktivitatskoeffizienten nach der DebyeHuckelKonvention wie in Gleichung 68 dargestellt (im weiteren Verlauf werden nur noch die molalen Koeffizienten ybetrachtet) logy+ =|z+/z_|logy+ (6 8) logy_ =|?_/?+|logy± Das DebyeHuckelModell ist wegen seiner Einfachheit das am häufigsten angewandte Verfahren zur Ermittlung von EinzehonenAktivitats koeffizienten Aus diesem Grund ist es auch schon in Form von Software Prozeduren in kommerzielle Blutelektrolytanalysatoren integriert In der Literatur gibt es jedoch keine Hinweise auf die Frage, wieweit das vereinfachte DebyeHuckelModell auf gemischte Elektrolytlosungen anwendbar ist Dienach DebyeHuckel berechneten Koeffizienten für Vollblut, Plasma oder Serum entsprechen demzufolge den Koeffizienten, die durch unabhängige Behandlung der einzelnen Elektrolyte nach Gleichungen 65und 68erhalten werden 48 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHENSENSOREN 642 StokesRobinsonHydratationstheone Stokes und Robinson ergänzten die DebyeHuckelTheone durch einen zusätzlichen Term, der die Hydratation miteinbezieht [4950] Durch H>dratation wird ein Teil des Wassers in der Hydratationssphare der Ionen gebunden und steht somit nicht mehr als frei bewegliches Losungsmittel zur Verfugung, was sich auf die EinzehonenAktivitats koeffizienten auswirkt Unter Berücksichtigung einer Konvention tur die Abschätzung von EinzehonenAkttvitatskoeffizienten nach Bates, Staples und Robinson [51], erhalt man eine Gleichung, die für gemischte Elektrolytlosungen anwendbar ist [52] ln(10)^AmV7 mol il lny+ = + " =— +h+mM, l+BmaV/moi" f In oois]^i)m;41 (6 9a) ln(\0)z2Am4r*J , _ lny = +h__rfiMh l+BmaV/molal f \ (6 9b) In 10 018^^ \)n aqI mit h+,h Hydratationszahl (Anzahl Mole Wassermolekule, die durch Hydratation an ein Mol Kationen resp Anionen gebunden sind, zB /i f=35) Na m Osmolahtat [molkg'] MHi0 Relative Molmasse von Wasser (0 018 kg mol ') 64Abschätzung der Einzelionen Aktivitatskoeffizienten inPlasma49 In dieser Approximationsmethode wird über alle in der Losung vorhandenen Ionen jsummiert Durch Einbezug der Osmolalitat werden Einflüsse elektrisch neutraler osmotisch aktiver Komponenten (z B Glucose Harnstoff) mitbeiucksichttgt 643 Das Pitzer Modell Pitzer entwickelte ein Approximationsmodell für gemischte Elektrolytlosungen, das nicht nur Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Kationen und Anionen miteinbezieht, sondern auch die gegenseitige Beeinflussung von Ionen gleicher Ladung untereinander mit beruckstchtigt [53] Dennoch ist das Verfahren relativ leicht anzuwenden und lasst sich auf Computerprogramme implementieren Ein Nachteil dieser sehr zuverlässigen und thermodynamisch fundierten Approximation hegt dann, dass nicht alle Parameter für physiologisch relevante Ionen bekannt sind Da diese Methode zuerst im Bereich der Geologie Anwendung fand, gibt es vor allem bei den organischen Anionen wie beispielsweise dem Acetat Ion Lucken in den tabelherten Parameter satzen 50 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN Für ein Salz MX in verdünnter wassriger Lösung gilt (c: cation; a: an um) [53]: ln/M =2MfY +25>a[BMa +(X m?)C Ma ]+2X '«t 6Mt a l +II»V"a[>7MB;j+7MCu+4'Mu] ^XI'^vKa']^ 11 ' l"7x =?xfY +2S/»t[Bxc +(I'^)CXL] +2lmJ0> l a +XX»W^b:+?xCj, +vpx1l] ^ c (' wobei X«? =XWc?c =XWaka| und /jmolal ^> , V/, ^hil +bVr^ ,+bV/molal b V / R Rl0) , 2P|y|X DMX PMX +2,molal aV1 (l+ccVr^je aV/ CMX ~ BMX ^\ ?MZx| (2ß(;x) a2(/molal) 1 l +|l +aV7iZ +a2/molal |eaV/m (610a) (610b) (611) (612) (613) (614) 64Abschätzung der Einzelionen Aktivitatskoeffizienten inPlasma 51 mit A0 DebyeHuckelParameter (für Wasser bei 37°C ist A^ 03995 kg"' mol "2) b, a Justierbare, universelle Parameter (b = 12 kg"2 mol "\ a=20kg"2 mol ,n) ß\ix> ßvix' ^mx Spezifische Parameter für das Salz MX, die Wechselwirkungen über kurze Distanzen repräsentieren Angepasst an eine Temperatur von 37 °C nach [53] 0^, 0Xl und Mischparameter für KationKation resp Anion 4/Mtl,vr'Mla, Anion Wechselwirkungen (nicht temperatur •PxV korrigiert) [53] Es ist zu beachten, dass die Mischparameter 0und ¥ nur einen sehr kleinen Beitrag leisten und deshalb oft vernachlässigt werden dürfen Den grossten Beitrag zur Mischung liefern die Parameter ß<0), ß"' und C, die von reinen Elektrolyten stammen 52 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN 644 Vergleich von Aktivitatskoeffizienten im physiologischen Bereich Im Bezug auf die Praxis ist es bei der Kalibiation von chemischen Sensoren für physiologische Anwendungen wichtig, die molalen Einzel lonenAktivitatskoeftiztenten zuverlässig abschätzen zu können, solange mit Kalibratoren, die auf wassrigen Losungen basieren, gearbeitet wird (vgl Kapitel 67) Aus diesem Grund sollte dasjenige Verfahren eingesetzt werden, welches die zuverlässigsten Resultate garantiert Wie aus Ab¬ bildung 61hervorgeht, lassensich im physiologischen Konzentrations¬ bereich keine grundlegenden Unterschiede im Verlauf der Einzehonen Aktivitatskoettizienten, berechnet nach der DebyeHuckelMethode, dem PitzerFormahsmus und der StokesRobinsonHydratationstheone, für die betrachteten Kationen feststellen Die Absolutwerte der Koeffizienten weichen jedoch voneinander ab Für die einwettigen Kationen wie Na+ und K+ werden mit der einfachen DebyeHuckelApproximation last identische Werte wie mit der auf¬ wendigeren PitzerApproximation erhalten Vernachlässigt man hingegen für zweiwertige Kationen wie Ca2+ und Mg2+ Mischterme, wie dies bei der Methode nach Debye und Huckel zutrifft, findet man grossere Ab¬ weichungen von den nach Pitzer erhaltenen Werten Im Rahmen dieser Arbeit wurde demzufolge tur alle Abschatzungen im Zusammenhang mit klinischen Messungen der rechnerisch aufwendigere PitzerFormalismus angewendet Chlorid wurde in sämtlichen Fallen als Gegenanion angenommen, da es den höchsten Anteil der Anionen im Plasma ausmacht Das BicarbonatAnion konnte aus experimentellen Gründen nicht bestimmt und daher nicht berücksichtigt werden 64Abschätzung der EinzehonenAktivitatskoeffizienten inPlasma 53 077 076 H J 075 074073 < < 140 145 150 155 1601 165 170 mNaW(mmolkg 0 ) 035 i++ 034 032 031 H ++ +++ + Ä5033°°O^ +++ +++ °°°°°o^ +++ ++ °Oo < o°o0 oo °Oo 140145 150 155 1601 165 170 mNa+/ (mmol kgHa0 ) Abb 61: Molale EinzelionenAktivitätskoeffizienten für Na+ (a) und Ca:+ (b) in Abhängigkeit der Na+Molalitäten in einer wassrigen Lösung mit physiologischem Hintergrund, abgeschätzt nach den Gleichungen von DebyeHückel (Gl 65 /68) (O), StokesRobinson (Gl 69a) () und Pitzer (Gl 610a) (+) (Bedingungen: T=37 °C; wR+= 47 mmol •kg~'i0, mCa!+= 12 mmolkgH)0, »i ,+= 06 Mg mmolkgHi0; Chlorid als Gegenion in allen Fällen) 54 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN 65 Aktivitäten versus Konzentrationen Mit dem Einzug der chemischen Sensoren bis heute in erster Linie der lonenselektiven Elektroden in die klinischen Laboratorien wurde die Erfassung einer neuen physikalischchemischen Grosse, dei aktiven Molalität des Analyten, ermöglicht (vgl Kapitel 62) Gleichzeitig stellte dieser Schritt die Routineanwender aber vor eine Reihe von neuen Fragen und Problemen Besonders wichtig ist die Beziehung zwischen der aktiven Molalitat m*q' eines Analyten und der totalen (molaren) Substanz¬ konzentration cPj0be, die mit den herkömmlichen Methoden erhalten wird Auch ist eine korrekte Kalibration des chemischen Sensors nicht immer einfach Es ist also nicht erstaunlich, dass sich eine ganze Reihe von Publikationen mit diesen Themenkreisen befasst [5457] Aus historischen Gründen betreffen die meisten Veröffentlichungen die Bestimmung von Natrium und Kahumionen mit ISE in Plasma oder Serumproben Die Mehrzahl der genannten Arbeiten befasst sich mit der Kontroverse zwischen Aktivitäts und Konzentrationsmessung und den daraus resultierenden Folgen für den Vergleich zwischen Messresultaten von ver¬ schiedenen Geraten Es soll darauf hingewiesen werden, dass hier in erster Linie der analytischtechnische Aspekt dieser Kontroverse be¬ trachtet wird und nicht der klinischmedizinische In den meisten Spitalern stehen heute vollautomatische Analysatoren mit einem sehr hohen Probendurchsatz für die Messung der wichtigsten klinischen Analyte in Blut, Serum oder Plasma im Einsatz Für die Bestimmung der Konzentration an Elektrolyten wird in diesen Geraten meist das Verfahren der indirekten Potentiometrie mit lonenselektiven Elektroden eingesetzt In diesem Fall wird die Probe stark verdünnt, was eine drastische Verschiebung der Komplexierungsgleichgewichte zur Folge hat Aus diesem Grund wird mit der indirekten Potentiometrie immer die Gesamtkonzentration c*rs°he an Ionen erfasst Gleichzeitig 65Aktivitäten versus Konzentrationen 55 befinden sich aber vor allem an peripheren Standorten und Notfallstationen auch Gerate im Einsatz, welche mit ISE die aktive Molalität m,'j' der freien Elektrolyte im wassrigen Anteil der unverdünnten Probe messen Auch im Falle des Einsatzes von optischen Sensoren in unverdünnten Proben werden die aktiven Molahtaten der Elektrolyte gemessen In den meisten Fallen wird aber das Resultat der Analyse in derselben Einheit von mmol LP'robLangegeben Die von verschiedenen Geraten erhaltenen Messwerte können somit beachtliche Differenzen autzeigen Um dieses Problem zu losen, hat eine Experten¬ kommission der "International Federation of Clinical Chemistry" (IFCC) empfohlen, eine Methode zur Standardisierung von ISE Methoden durch Verwendung von frischen Humanseren auszuarbeiten [58] Darauf veröffentlichte eine Arbeitsgruppe der IFCC, welche sich mit lonen¬ selektiven Elektroden befasst, einen Entwurf mit dem Titel "Recommendations for Nomenclature, Definitions, and Conventions Relativ to the Use of lonSelective Electrodes for BloodElectrolyte Analysis" [59] Dieses Dokument befasst sich mit der Bestimmung von Elektrolytkonzentrationen in unverdünntem Plasma, welches durch Abtrennung der Blutzellen von antikoaguhertem Blut erhalten wurde Es beinhaltet Empfehlungen, wie die Messresultate dargestellt und wie sie in Zusammenhang mit den Ergebnissen von Referenzmethoden gebracht werden sollen Komplikationen rühren von der Tatsache her, dass lonen¬ selektive Elektroden in der unverdünntenProbe eine Fraktion des Analyten erfassen, welche sich von der Gesamtkonzentration unterscheidet Diese einzigartige Möglichkeit liefert zwar wertvolles Wissen über die biologische Aktivität von Ionen, fuhrt aber dazu, dass die erhaltenen Resultate nicht konsistent mit den Gesamtkonzentrationen sind, welche durch indirekte Potentiometrie, Flammenphotometne, Atomab sorptionsspektrometne oder kombinierte, komplexometrische und photo¬ metrische Verfahren erhalten werden In einem Versuch, Resultate aus direkten ISEMessungen in Einklang mit Messwerten aus der indirekten 56 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHENSENSOREN Potentiometrie in der verdünnten Probe oder anderen Methoden zu bringen, schlagt das IFCCDokument vor, einen Algorithmus anzuwenden, um die Ergebnisse aus der direkten Potentiometrie umzurechnen Die Absicht ist es, die Resultate von verschiedenen Mess¬ methoden in derselben Einheit (mmol LP'rohl_) anzugeben Es besteht jedoch die Gefahr, dass diese Prozedur zu einer übermässig vereinfachten Interpretation von individuellen Messwerten fuhrt Dies insbesondere dann, wenn der Anteil an Wasser in der Probe stark vom Normwert abweicht Ferner muss beachtet werden, dass sich der Algorithmus nur gerade auf die einwertigen Kationen Natrium und Kalium anwenden lasst Heute ist es aber auch möglich, mit direkter Potentiometrie die zwei wertigen Ionen Calcium und Magnesium zu erlassen In diesem Fall ist ein Vergleich mit herkömmlichen Methoden mit der Bestimmung der Gesamtkonzentration ohnehin nicht mehr mit einem einfachen Algo¬ rithmus möglich Diese Ionen liegen zu einem hohen Grad als Komplexe gebunden vor Zusatzlich ist der Komplexierungsgrad stark von weiteren Parametern abhangig, wie zum Beispiel vom pH Wert und der Ionenstarke 66 Umrechnung von Ionenaktivitäten inIonenkonzentrationen 57 66 Umrechnung von Ionenaktivitäten in Ionenkonzentrationen Wie in Abschnitt 65 erläutert, ist die Grösse der aktiven Molalität m"^'1 aus historischen Gründen bis heute kein allgemein akzeptierter und verbreiteter Parameter in der klinischen Chemie Da aber mit einem chemischen Sensor gerade diese Grösse erfasst wird, ist eine an¬ schliessende, mathematische Datenumrechnung unvermeidbar Der von der IFCC vorgeschlagene Formalismus (Gleichungen 620 und 621) wird im folgenden Abschnitt hergeleitet: Die totale (molare) Substanzkonzentration c^r}°hc des Ions jin einer Probe des Probanden ikann in die folgenden drei Fraktionen eingeteilt werden: Die freie Substanzkonzentration in der Wasserphase caiJ', der komplex gebundene Anteil c,dj\ sowie der Anteil in der nichtwässrigen Phase nonaq MProbe _ ,aq CiJ ~C'iI +1ProbL durch Umrechnung nach Gleichung 624 einen Fehlerbeitrag zum Analysenresultat von mehr als 05 Prozent bei 20 der untersuchten Individuen, wenn für die Massenkonzentration von Wasser der Mittelwert p"H'° (in diesem Fall tur gesunde Probanden) an Stelle der Individualwerte p, ' eingesetzt wird 662 Individuelle und mittlere molale Ionenstarke Die molale Ionenstarke /,mola' gehört zwar nicht zu den direkten Einflussfaktoren für die Datentransformation, sie bestimmt jedoch in erster Linie die Grosse der molalen EinzehonenAktivitatskoeffizienten und wird daher in die Betrachtungen miteinbezogen In Tabelle 62findet man eine Zusammenstellung der Mittelwerte 7mohl sowie der 95%Ver trauensintervalle von molalen Ionenstarken in menschlichem Plasma, ermittelt aus experimentellen Daten nach Gleichung 67b Diese Werte wurden mitunter als Grundlage für die Abschätzung der molalen Einzel lonenAktivitatskoeffizienten verwendet In Abbildung 63 sind die Resultate graphisch dargestellt Die tieferen Werte für Patienten mit Herz¬ beschwerden lassen sich auf geringere freie Natriumionenkonzentrationen cp"obet zurückfuhren, welche innerhalb dieser Probandengruppe oft beobachtet wurden Da das Natnumion den höchsten Anteil der Kationen im menschlichen Blut darstellt, ist die freie Natriumionenkonzentration der dominierende Faktor für die Ionenstarke Allgemein wird diese Tatsache beispielsweise in klinischen Elektrolytanalysatoren, basierend auf ISE, für die Abschätzung der Ionenstarke ausgenutzt 66 limrcchnuna von lonenaktivitäten inIonenkonzentrationen 65 Tabelle 62: Experimentell bestimmte, mittlere molale Ionenstärke 7mola' in Humanplasmen von gesunden Probanden und von Patienten mit ver¬ schiedenem medizinischem Status tmolal Gesunde Vor Nach Herz¬ Gesamt [mmolkgH'i0] DialyseDialyse versagen (n=36) (n=18)(n=13) (n=15)(n=82) Mittelwert 1609 1584 1590 1541 1588 95%Intervall 1604 1614 1570 1598 1580 1600 1513 15691580 1596 164 °160 "öEE 156 152 148 VD ND HV Abb 63: Molale Ionenstärke /lmol'd gegliedert nach Probandengrttppen; (Darstellung analog zu Abb 62) 66 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN Aus Tabelle 62und Abbildung 63lasst sich entnehmen, dass die Ionen¬ starke sich in allen pathologischen Fallen von derjenigen für gesunde Probanden unterscheidet Dies wirkt sich direkt auf die Einzehonen Aktivitatskoeffizienten aus, da diese hauptsächlich von der Ionenstarke abhangen Da die Aktivitatskoeffizienten mit steigender Ionenstarke abnehmen, wird für erstere ein verglichen mit /,mohl umgekehrtes Verteilungsmuster erwartet, was in Abschnitt 663 auch bestätigt gefunden wird 663Individuelle und mittlere molale EinzehonenAktivitatskoeffizienten In der Tabelle 63sowie in der Abbildung 64sind die Mittelwerte yi sowie die 95%Vertrauensintervalle der molalen EinzehonenAktivi tatskoeffizienten, abgeschätzt aus experimentellen Daten nach der Methode von Pitzer (vgl Gleichungen 610 bis 614), für die verschiedenen Gruppen von Probanden zusammengefasst Sämtliche Daten beziehen sich auf die physiologische Temperatur 37 °C Über alle Probanden gesamthaft betrachtet zeigen im Falle von Na+, K+ und Cl die Koeffizienten relative 95%Vertrauensintervalle unterhalb von 006 Prozent Für die zwei¬ wertigen Ionen Ca2+ und Mg,+ liegen die Werte unterhalb von 014 Prozent Die grossten Streuungen findet man in der Gruppe der Patienten mit Herzerkrankungen Wie schon im Falle der Ionenstarke lassen sich auch diese Variationen hauptsächlich auf die grosseren Schwankungen der freien Natriumionenkonzentration zurückfuhren Auch bei den Aktivitats¬ koeffizienten findet man signifikante Unterschiede zwischen Probanden aus den pathologischen Gruppen und gesunden Probanden Es muss jedoch beachtet werden, dass diese Unterschiede zwar statistisch signifikant, als relative Differenzen betrachtet aber gering sind 66Umrechnung von lonenaktivitäten inIonenkonzentrationen 67 Tabelle 63 Experimentell bestimmte, mittlere EinzehonenAktivitats koetfizienten y] in Humanplasmen von gesunden Probanden und von Pati¬ enten mit verschiedenemmedizinischem Status Probanden¬ Ion gruppe Gesunde Mittelwert (n=36) 95%Intervall Vor Mittelwert Dialyse 95%Intervall (n=18) Nach Mittelwert Dialyse 95%Intervall (n=13) Herz¬ Mittelwert versagen 95%Intervall (n=15) Gesamt Mittelwert (n=82) 95%Intervall Na+ K+ Cl Ca1+ Mg2 07430 07263 07446 03417 03507 07428 07261 07444 03414 03505 07432 07265 07448 03420 03509 07440 07276 07455 03430 03520 07434 07269 07450 03422 03512 07446 07283 07460 03438 03528 07438 07273 07452 03428 03518 07434 07268 07448 03422 03513 07442 07278 07456 03434 03523 07458 07297 07474 03455 03542 07446 07283 07463 03439 03527 07470 07311 07485 03471 03557 07438 07274 07454 03429 03518 07441 07270 07451 03424 03514 07435 07278 07457 03434 03522 68 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN 0750n 0748 Na+ 0734 0732 0730 0728 0726 1 0358 0356 0354 0352 0350 1 K+ 0746^ —i— 0744 r — h i 0742 1 0350 0348 II 1 1 G VD ND „2+ Ca HV i i 1 1 G VD ND Mg2+ HV 0346 0344 |i 0342 0340 1— —1 1— —1 i— =i i— —1 1 C7"T3 V D IN 1D H V c7"T VD i iND HV er 0750 0748 wi Ä 0746^ 1 —j 0744 E3 r~ ^ 1 1 G VD ND HV Abb 64: Molale EinzelionenAktivitätskoeffizienten von Na+, K+, Ca2+, Mg2+ und Cl in Humanplasma, abgeschätzt aus experimentellen Daten nach dem PitzerModell, gegliedert nach Probandengruppen; (Darstellung analog zu Abb 62) 66Umrechnung von lonenaktivitäten inIonenkonzentrationen 69 In Analogie zu Abschnitt 661kann auch an dieser Stelle der Fehler¬ beitrag der Variationen in den molalen EinzehonenAktivitatskoef fizienten auf das Analysenresultat des Sensors im Falle einer Konzentra¬ tionsbestimmung nach IFCC abgeschätzt werden Die Resultate sind in Tabelle 64zusammengefasst Betrachtet für die EinzehonenAktivitats¬ koeffizienten findet man relative Abweichungen vom Mittelwert von gesunden Probanden |e,''| über 05 Prozent bei Na+ und Cl für5 Individuen, bei 7Individuen für K+ und bei 23 Individuen für Ca2+ und Mg2+ nach Gleichung 628 £*' =(7l7n)/Yl) (6 28) Bei einer Umrechnung von gemessenen aktiven Molahtaten m*q in molare Substanzkonzentrationen ^|pjobe nach Gleichung 624 unter Ver¬ wendung von Mittelwerten der Aktivitatskoeffizienten y} werden in den oben aufgezahlten Fallen Beitrage von mehr als 05Prozent zum gesamten Fehler der Analyse geliefert Besonders häufig treten grossere Ab¬ weichungen vom Mittelwert bei Patienten mit Nierenbeschwerden vor der Hämodialyse, sowie bei herzkranken Patienten auf der Intensivstation auf In beiden Fallen sind Störungen im Elektrolythaushalt des Korpers Be¬ standteil des Krankheitsbildes Da gerade für diese Patientengruppen die Erfassung von freien Elektrolytkonzentrationen besonders relevant ist und sich der Einsatz von peripheren Sensorgeraten hier anbietet, sollte diese Tatsache keineswegs unbeachtet gelassen werden 70 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN 664 Komplexierung von zweiwertigen Kationen In Abbildung 65 ist der in der Probe frei vorliegende Anteil a, der Ionen Ca2* und Mg2+ in Abhängigkeit der Probandengruppe dar¬ gestellt Die Werte wurden experimentell aus den Differenzen der gemes¬ senen totalen Substanzkonzentration eund der freien Ionenkonzen¬ tration im wassrigen Probenanteil c1p,"t'e't bestimmt und sind nicht pH korrigiert1 Eine rechnerische Bestimmung von c1p'obe wäre für beide Ionen nur dann sinnvoll, wenn der Komplexierungsgrad in allen Fällen gleich gross wäre und dadurchwie in Gleichung 624 als Konstante behandelt werden könnte Aus Abbildung 65 geht jedoch hervor, dass diese Grösse erheblichen Schwankungen unterworfen ist Dies insbe¬ sondere dann, wenn die Probe nicht anaerob behandelt wird und es dadurch zu Veränderungen des pHWertes kommt 52 Ca2+ 76 72 68 064 z 60 ?56 a 52 48 44 1 Mg2 + 1— It« Mg —1 ^48 h H P —| oa 44 40 M M C l 5 V ] D NDHV C3 iV ! D ND HV Abb 65: Experimentell bestimmte, freie Anteile an Ca2+ und Mg2+ in Prozent der entsprechenden totalen Substanzkonzentration in Humanplas¬ ma, gegliedert nach Probandengruppen; (Darstellung wie in Abb 62) 1ISEEIektrolytAnalyzcr bieten inder Regel die Möglichkeit zur Korrektur der pHabhängigen Messwerte der freien Ionenkonzentrationen von Ca:* und Mg:+ auf einen physiologischen pHWert von 740 [61, 62] 66 Umrechnung von lonenaktivitäten inIonenkonzentrationen 71 Betrachtet man die relativen Abweichungen e" des Anteils frei vorliegender Ionen vom Mittelwert für gesunde Probanden nach Gleichung 629, so wird für das Ca2+Ion und für das Mg'+Ion bei 75 der 82 untersuchten Individuen ein Wert von 05Prozent überschritten Die mittleren, relativen Abweichungen für die einzelnen Probandengruppen sind in Tabelle 64aufgeführt e^' =(w,a1J)/a1J (6 29) Dies bedeutet, dass der Fehlerbeitrag zum Analysenresultat infolge der Datenumrechnung nach Gleichung 624 alleine von der variablen Ionen komplexierung für fast alle untersuchten Proben mehr als 05 Prozent betragt Die Resultate der vorangehenden Untersuchungen zu den einzelnen beein¬ flussenden Parametern p,H'°, y, und al} sind in Tabelle 64zusammen¬ gestellt Die Übersicht beinhaltet alle durch die Datenumrechnung verursachten, relativen Fehlerbeitrage |e, |in Abhängigkeit der einzelnen relevanten Grossen 72 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN Tabelle 64: Mittlere relative Fehlerbeiträge |e|, die auftreten, wenn Mittelwerte gesunder Probanden (Gl 623 / 624) anstelle von individuellen Daten (Gl 620 /622) zur Datenumrechnung eingesetzt werden Die Resultate sind aufgelistet nach den einzelnen, beeinflussenden Parametern Alle Angaben in Prozent des Messwertes Parameter Gesunde Vor Nach Herz Gesamt Dialyse Dialyse versagen (n=36) (n=18) (n=13) (n=I5) (n=82) AHl0 Mittel 024 034 059 040 035 95% 019 030020 048 039 079 020 060 029 041 'Na* Mittel 005 015 011 038 014 95% 003 007 008 022 006 016 023 053 010 018 V Mittel 007 019 014 047 018 95% 005 009 010 028 008 020 039 065 013 023 rcr Mittel 005 013 009 038 014 95% 003 007 007 019 004 014 023 053 010 018 y^ Mittel 016 045 034 112 043 95% 011 021 024 066 018 049 069 155 031 055 66Umrechnung von lonenaktivitäten inIonenkonzentrationen 73 Tabelle 64' Fortsetzung Parameter Gesunde Vor Nach Herz Gesamt Dialyse Dialyse versagen (n=36) (n=18) (n=13) (n=15) (n=82) 'Mir Mittel 015 041 031 102 039 95% 010 020 022 060016 046062 142 028 050 ac Mittel 228 565 686 429 411 95% 167 289 415 715 271 1100 263 595 326 496 °v Mittel 301 352 2699 453 720 95% 220 381 147 556 1789 3609 229 677 482 958 665 Transformation von aktiven Molalitäten in freie (molare) Ionen¬ konzentrationen Bis jetzt wurden die relativen Beiträge der Massenkonzentration von Wasser, der molalen EinzelionenAktivitätskoeffizienten und der Komplexierung (im Falle der zweiwertigen Kationen Ca2+ und Mg2+) zum resultierenden Umrechnungsfehler getrennt analysiert An dieser Stelle sollen nun die umrechnungsinduzierten Abweichungen ef,f gesamthaft nach Gleichung 625 betrachtet werden Die Resultate sind in Tabelle 65 und in Abbildung 66 dargestellt Es ist zu beachten, dass auch für die Ionen Ca2+ und Mg2+ lediglich die Umrechnung von aktiven Molalitäten m^'1 zu freien Ionenkon 74 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN zentrationen cPr"bel berücksichtigt wird Eine allfalhge Ermittlung der totalen Substanzkonzentration c1Probc wird nicht diskutiert, da wegen der starken Schwankungen im Komplexierungsgrad eine Umrechnung eines mit einem Sensor erhaltenen Messwertes nach Gleichung 624 nicht sinnvoll ist und m der Regel auch nicht durchgeführt wird Die dabei resultierenden Fehlerwerte waren um ein Mehrfaches grosser als diejenigen, welche durch die Ermittlung der freien Ionenkonzentration £,pJrobe' nach Gleichung 623 erhalten werden 66Umrechnung von lonenaktivitäten inIonenkonzentrationen 75 Tabelle 65 Mittlere relative Fehlerbeitrage Ec ,die auftreten, wenn Mittelwerte gesunder Probanden (Gl 623) anstelle von individuellen Daten (Gl 620) zur Umrechnung von aktivenMolalitaten in freie, molare Ionenkonzentrationen eingesetzt werden Die Resultate sind getrennt für die einzelnen Ionen aufgelistet Alle Angaben in Prozent des Messwertes Ionj Gesunde Vor Nach Herz Gesamt Dialyse Dialyse versagen (n=36)(n=18) (n=13)(n=15) (n=82) Na+ Mittel 024 031 061 027 032 019 021 040 015 027 95% 030 0 42 083 038 038 K+ Mittel 024 032 062 029 033 019 023 0 40 017 027 95% 030 042 084 042 039 Cl Mittel 024 032 060 026 032 019 020 039 015 026 95% 030 043 081 038 0 37 Ca,+ Mittel 0270 43 078 079 048 020 028 056 043 039 95% 034 059 100 115 058 Mg,+ Mittel 027 0 40 075 069 045 020 025 053 037 0 36 95% 034 054 098 102 054 76 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN ^ 10 08 06 04 02 00 Na G VD ND HV 20 16 1? Ca2+ 08 04 00 1: _ r"""^ —r 10 08 ;o6 r04 02 00 Cl" l j tz I 10 08 06 04 02 00 K+ i ZD I I I ^ 16 12 Mg2+ 08 l— 04 i oo —*— I —IVD NDHV G VD ND HV Abb 66: Durch Datenumrechnung nach Gleichung 623 verursachte relative Abweichungen Ef 'fürdie Ionen Na+, K+, Ca2+, Mg2+ und Cl in Prozent: (Darstellung analog zu Abb 62) 66 Umrechnung von lonenaktivitäten inIonenkonzentrationen 77 Die in Tabelle 65zusammengefassten Resultate belegen, dass die freie, molare Substanzkonzentration cProbe' nicht in allen Fallen mit genügender Sicherheit aus gemessenen aktiven Molalitäten m*q ermittelt werden kann Das Risiko, neben dem analytischen Fehler der Messmethode einen zusätzlichen Beitrag zum Gesamtfehler der Analyse durch mathematische Datentransformation einzufuhren, ist nicht vernachlassigbar In der Gruppe von Probanden nach erfolgter Behandlung durch Hämodialyse ist das Fehlernsiko am grossten Vor allem bei den einwertigen Ionen unterscheidet sich diese Gruppe von Patienten klar von den übrigen Probandengruppen Bei den zweiwertigen Ionen, wo allgemein grossere Differenzen auftreten, heben sich die Gruppen der Patienten nach der Hämodialyse und die Patienten mit Herzbeschwerden von den übrigen Probanden ab Zu Beginn von Kapitel 66 wurde erwähnt, dass es aus der Sicht des Mediziners für die diagnostische Interpretation der Daten entscheidend sein kann, in welche Richtung die Abweichungen durch rechnerische Datentransformation aultreten Abbildung 67zeigt die Histogramme mit dem Verteilungsmuster der Gesamtabweichungen ef' für die einzelnen Ionen 78 KLINISCHE IONEN ANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN 40 Na + 48 20 o 21 9 9 11 27 _8_ 15 34 20 G VD ND HV Tot' 60 40 N 20 0H 20 Ca 23 13 "TänrTi" 13 62 20 i 1 i r G VD ND HV Tot 40 20 20 Cl 48 21 9 11 7 15 9 2 _8_ 34 I I 40 20 0 20 G VD ND HV Tot 40 Mc 2+ 59 20 o 22 12 13 12 14 L6J 0 3 23 20 G VD ND HV Tot Eu >0 £l] <0 G VD ND HV Tot Abb 67: Häufigkeit Nder relativen Abweichungen ef'j (Gleichung 625) in positiver respektive negativer Richtung, dargestellt für die untersuchten Ionen 66Umrechnung von lonenaktivitäten inIonenkonzentrationen 79 Wie aus Abbildung 67hervorgeht treten die beobachteten relativen Ab¬ weichungen e'' vermehrt mit positivem Vorzeichen auf Dies bedeutet, dass die nach Gleichung 623 aus Mittelwerten abgeschätzten freien Ionen¬ konzentrationen e>Pro1*'' für die Mehrzahl der untersuchten Individuen grosser als die wahren Werte c,p[obct, berechnet mit den individuellen Daten ausfallen Hauptverantwortlich für diese Beobachtung ist eine gegenüber dem Mittelwert im allgemeinen leicht erniedrigte Massen konzentration von Wasser p,H,°, wie dies sehr deutlich bei Patienten nach der Behandlung durch Hämodialyse zum Ausdruck kommt Für den Arzt besteht somit die Gefahr einer Fehldiagnose, verursacht durch vermeintlich erhöhte Laborwerte für die Elektrolyte Das Ausmass der in Tabelle 65angegebenen Abweichungen lasst sich am besten beurteilen, wenn sie mit den idealerweise diagnostisch zulassigen Fehlern verglichen werden Diese werden oft unabhängig vom Analyten auf 1% festgesetzt Daneben existieren aber auch Richtlinien, die sich an der intraindividuellen biologischen Variation der einzelnen Analyte orientieren Gemäss den Richtlinien des CAP (College of American Pathologists) [63 64], berechnet sich der total zulassige analytische Fehler cva für die Bestimmung einer klinisch relevanten Grosse nach Gleichung 630 mit cva Totaler, zulassiger, analytischer Fehler cvb mtrd Biologische, intraindividuelle Variation [65] 80 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN Tabelle 66 Totaler, zulassiger analytischer Fehler, berechnet nach den Richtlinien des CAP Analyt Total zulassiger analytischer Fehler cvd [%] Na+ 03 K+ 22 Ca"+ 085a Mg2+ 1la Cl 07 aWerte für die totale Ionenkonzentration cvbmlri für freie Ionenkonzen¬ tration nicht verfugbar Beim Vergleich der Daten in Tabelle 65und 66muss man feststellen, dass für das Na+Ion alleine der Beitrag der Datenumrechnung zum analytischen Fehler den Wert des totalen, idealerweise zulassigen Fehlers bereits überschreitet oder annähernd erreicht DieZahlen in Tabelle 65 enthalten aber noch keine Fehlerbeitrage, verursacht durch die Mess¬ methode an sich Besser sieht die Situation im Falle des K+Ions aus Hier vermag der durch den Umrechnungsalgonthmus nach Gleichung 623 verursachte Fehlerbeitrag den total zulassigen analytischen Fehler nicht zu erreichen Für die beiden zweiwertigen Kationen Ca2+ und Mg2+, sowie das Amon Cl, werden die total zulassigen analytischen Fehler nicht überschritten, für manche Probandengruppen (nach der Hämodialyse, Herzversagen) jedoch nahezu erreicht Es ist zu beachten, dass es sich bei den Zahlen in Tabelle 66um Idealwerte handelt, die aber in der heutigen Laborpraxis in der Regel nicht erreicht werden (vgl Abschnitt 915) Eine Reduktion der analytischen Fehler drangt sich auf Um so mehr 66 Umrechnung von lonenaktivitäten inIonenkonzentrationen 81 müssen zusätzliche Fehlerbeitrage, die nicht durch die Messmethode selbst, sondern durch rechnerische Datentransformation verursacht werden ausgeschlossen werden Die erhaltenen Resultate belegen am Beispiel von lediglich zwei pathologischen Probandengruppen, bei welchen der Elektrolythaushalt eine entscheidende Rolle spielt, dass durch die Umrechnung von gemessenen aktiven Molalitäten in freie oder totale Ionenkonzentrationen ein relativ hohes Fehlemsko eingegangen wird In dieser Studie wurden keine Proben von Patienten, die unter starker Hypo Hydratation leiden, mituntersucht Auch für solche Falle werden aber grossere Abweichungen auf Grund der Variationen in der Massenkonzentration von Wasser erwartet Wegen des experimentell wesentlich höheren Aufwandes ist eine Datentransformation unter Berücksichtigung individueller Aktivitats¬ koeffizienten und Massenkonzentrationen von Wasser auch keine allgemeine Losung für dieses Problem Zusatzlich muss bei der experimentellen Bestimmung der Massenkonzentration von Wasser bedacht werden, dass die zuvor beschriebene Methode selbst Unsicherheiten mit sich bringt Klinisch betrachtet, ist das Resultat einer aktiven Molahtatsbestimmung ohnehin wertvoller als die Konzentrations¬ messung 82 KLINISCHE 1QNENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN 67 Kalibration chemischer Sensoren für physiologische Proben Da die korrekte Kalibration eines Sensorsystems entscheidend fut die Qualität des Analysenresultates ist, sollen an dieser Stelle einige grundsatzliche Hinweise zu diesem Thema im Hinblick auf die Anwendung in klinischen Proben gegeben werden Die hier getroffenen Überlegungen sind in der Regel für alle Typen von chemischen Sensoren gültig Ein Spezialfall für die Kalibration von potentiometnschen Sensoren wird in Kapitel 69diskutiert Prinzipiell stehen für dieKali¬ bration eines chemischen Sensors für den Direkteinsatz (d h ohne Ver¬ dünnung) in der klinischen Probe zwei verschiedene Möglichkeiten zur Wahl Dabei stosst man auf die Frage ob der Sensor für die Messung der (molaren) Substanzkonzentration oder der aktiven Molalitat kalibriert werden soll Der Sensor kann einerseits mit wassrigen Losungen bekannter Zusammen¬ setzung kalibriert werden oder aber es werden Losungen verwendet, die mit Proteinen versetzt sind und somit den physiologischen Proben am nächsten kommen In beiden Fallen kann die Kalibration mit oder ohne Hintergrund von potentiell interferierenden Komponenten durchgeführt werden Im Extremfall gelangen sogar physiologische Proben mit bekanntem Gehalt des zu kalibrierenden Analyten zum Einsatz Diese müssen zuvor mit einer unabhängigen Referenzmethode analysiert worden sein Je nach Zielgrosse bietet die eine oder die andere Methode gewisse Vorteile In einfachen wassrigen Losungen bekannter Zusammensetzung lassen sich beispielsweise für Elektrolyte relativ leicht und zuverlässig die EinzehonenAktivitatskoeffizienten nach der Methode von Pitzer abschätzen Somit wird die Kalibration des Sensors auf der Basis der aktiven Molalitaten ermöglicht Dies bedeutet, dass aus dem Messsignal direkt das Resultat in Form der aktiven Molalität erhalten wird Alle resultierenden Fehler sind somit durch die Messmethode selbst (z B 67Kalibration chemischer Sensoren für physiologische Proben 83 Selektivitatsprobleme), sowie duich geringe Unsicherheiten in der Abschätzung der Aktivitatskoeffizienten gegeben Probleme ergeben sich lediglich in den Fallen, in denen eine Abschätzung der Aktivitats¬ koeffizienten nicht zuverlässig möglich (fehlende Parameter) oder problematisch (z B neutrale Analyte) ist Wird die Kalibration mit wassrigen Losungen durchgeführt, die einen konstanten physiologischen Elektrolythintergrund haben, können auch Selektivitatsprobleme, sowie das Flussigkeitspotential (vgl Kap 51und 69) weitgehend eliminiert werden Allerdings wird dadurch die mathematische Abschätzung der EinzehonenAktivitatskoeffizienten erschwert und es muss sichergestellt sein, dass ein zuverlässiger, plausibler Berechnungsformalismus (z B nach Pitzer) zur Verfugung steht Wie in Abschnitt 66 ausführlich dargestellt, ist aber in der klinischen Chemie die Grosse der freien oder der totalen (molaren) Ionen¬ konzentration gebräuchlich Diese wird einerseits durch die im voranstehenden Kapitel beschriebene Umrechnung erhalten, oder aber durch die Kalibration des Sensors auf der Basis von Konzentrationen unter möglichst probennahen Bedingungen Dazu verwendet man protein haltige Losungen oder physiologische Proben Beide Verfahren verbergen die gleichen potentiellen Fehlerquellen In beiden Fallen wird davon ausgegangen, dass die Aktivitatskoeffizienten für den Analyten in der Probe und im Kahbrator identisch sind respektive in der Probe unverändert bleiben Die gleiche Annahme gilt für die Massen konzentration von Wasser Abweichungen von diesen Annahmen haben Fehler im Analysenresultat wie in Kapitel 66 gezeigt zur Folge 84 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN 68 Abschätzung der Massenkonzentration von Wasser durch Vergleich von lonenaktivitäten und Ionenkonzentrationen Gleichungen 620 und 622 zeigen, dass das Verhältnis der totalen Ionenkonzentration cProbe und der aktiven Molalität m1^' von der Massenkonzentration von Wasser p, abhangig ist Dies gestattet es theoretisch, dienicht direkt messbare Massenkonzentration von Wasser aus den routinemassig zugänglichen Werten für die totale Ionen konzentration und die aktive Molalitat abzuschätzen Dieses Verfahren wird beispielsweise in einem kommerziell erhältlichen Analyzer der Firma NOVA Biomedical1 zur Aufdeckung von Anomalien im Wassergehalt der Probe eingesetzt [66] Dazu werden die Messwerte für das Na+Ion, erhalten mit ISE in der unverdünnten Probe (proportional zu maqf j), mit denjenigen, erhalten durch die indirekte Potentiometrie (entspricht c" )verglichen An dieser Stelle soll nun untersucht werden, inwiefern dieses Verfahren für die in dieser Arbeit untersuchten Proben anwendbar ist und ob sich die Methode auch auf andere Kationen übertragen lasst Dazu wurde ein einfaches lineares Regressionsmodell aufgestellt A =ßc V'"'J J c/in ( Probt ^ ClJvaclt m, +CONST +E, (6 31) mit ß(/„, Regressionskoeffizient für den Quotienten aus cProbe und m")' E, Zufällige Abweichungen vom Modell Die Regression wurde mit allen 82 Datensätzen durchgeführt Die Resultate sind in Tabelle 67 zusammengefasst Im postulierten Modell wird der Quotient aus c,Probc und m*q[ als fehlerfreie erklärende Variable NOVA NUCLEUS(NOVA BIOMEDICAL GmbH Rüdermark Germany) 68Abschätzung der Massenkonzentration von Wasser 85 betrachtet Der Ausdruck E, repräsentiert die Residuen, das heisst den nicht durch die erklärende Variable und die Konstante erfassten Beitrag zum Modell Als experimentelle Parameter wurden für die statistische Analyse einerseits die mit indirekter Potentiometrie oder Photometriebestimmte totale (molare) Ionenkonzentration und andererseits der aus der direkten Potentiometrie (unverdünnte Probe) stammende Messwert, der direkt proportional zur aktiven Molalität ist, eingesetzt In Abbildung 68sind die der Regression zugrundeliegenden individuellen Quotienten von c1Probe und int'q' gegenüber der Massenkonzentration von Wasser graphisch dargestellt 86 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN 1094 Jj?093 0921 Na —I ' 1 ' 1 092 094 096 094 K+ " • D*"~^^^ 093 •^^ "T 1 ' l ' 090 100 Probe /w aq,f (c /m )/(kgH0L Probe) 1094 CT)093 092 Ca i 1 1 1 1 1 r 200 220 240 Probe *, aq,f 094 093 092 4 Mg 2+ i 1 1 , 1 1 160 200 240 (c /m )/(kgH0L Probe) Abb 68: Zugrundeliegende experimentelle Datenpunkte (o), Regressions¬ gerade (ausgezogene Linie) und 95%Vertrauensband (unterbrochene Linie) für das lineare Regressionsmodell (Methode der kleinsten Fehler¬ quadrate) nach Gleichung 631 Alleine die Betrachtung von Abbildung 68 zeigt, dass sich die experimentell bestimmten Daten nicht vollständig durch einen einfachen, 68Abschätzung der Massenkonzentration von Wasser 87 linearen Zusammenhang beschreiben lassen Bei der Regression nach Gleichung 631 wurden bewusst keineAusreisser aus der Datenanalyse ausgeschlossen, denn es sollte die Gültigkeit der Modellbeziehung für alle betrachteten Individuen abgeklärt werden Aus diesem Grund sind auch offensichtliche Extremwerte, denen möglicherweise mit den beobachteten Parametern nicht erfassbare medizinische Faktoren zugrunde liegen, im Regressionsmodel] mitberucksichtigt Dementsprechend fallt auch das Resultat der Regressionsanalyse (Methode der kleinsten Fehlerquadrate) aus, wie aus Abbildung 68und Tabelle 67entnommen werden kann Die Messwerte tur das hier betrachtete Gesamtkollektiv von Probanden lassen sich durch das nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate gefundene lineare Modell nicht korrekt beschreiben Die Daten verlangen nach einer anderen Regressionsmethode Einzelne Individuen üben eine sehr starke Hebelwirkung auf die Regressionsgerade aus, was besonders deutlich für das K+Ion zutrifft Für die Betrachtung der Extrema als Ausreisser, verursacht durch messtechnische oder experimentelle Fehler, lagen innerhalb der erfassten klinischen Grossen keine Indizien vor Deshalb wurden die entsprechenden Daten nicht aus dem Datensatz ausgeschlossen 88 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN Tabelle 67 Resultate aus der einfachen linearen Regressionsanalyse (Methode der kleinsten Fehlerquadrate) nach Gleichung 631 (R" Bestimmtheitsmass) Ionj ß/ CONST R1 95%Vertrauensbereich 95%Vertrauensbereich [xlO1] Na+ 191 58 ±81 06 0750 ±0077 0218 K+ 30 11 ±3165 0904 ±0030 0043 Ca,+ 16 25+ 770 0966 ±0 016 0182 Mg,+ 1071+ 436 0950 ±0007 0232 Für alle Ionen jwurde ein kleines Bestimmtheitsmass R1 gefunden, was auch aus Abbildung 68gut ersichtlich ist Für Kalium kann überhaupt nicht mehr von einer Korrelation im Sinne des aufgestellten Modells gesprochen werden Insbesondere ist auch das relative 95%Vertrauens mtervall der Steigung für dieses Ion sehr gross und die Steigung deshalb nicht mehr signifikant von Null verschieden Dafür verantwortlich sind die auftretenden Extremwerte, wie aus Abbildung 68sehr gut ersichtlich ist Im Falle eines Ausschlusses der 4Extrema (Quotient >10oder <09) verbessert sich das Bestimmtheitsmass auf einen Wert von 0185 und ist somit mit demjenigen von Ca,+ vergleichbar Ferner findet man eine Steigung der Regressionsgerade, die nahezu derjenigen von Na+ entspricht Wie bereits erwähnt, fehlt für diese Ausreisserehmination aber eine plausible Begründung Für die übrigen Elektrolyte Na+, Ca^+ und Mg2+ sind keine grossen Unterschiede im Bestimmtheitsmass zu beobachten Dieses Resultat überrascht insofern, als das Verhältnis von cProbe un(j ^aq i ^uT ^ zweiwertigen Ionen stark vom 68Abschätzung der Massenkonzentration von Wasser 89 Komplexierungsgrad abhangt, dergrossen Schwankungen unterliegt (vgl Abb 65) Die negative Steigung für Ca2+ und Mg2+ lasst sich damit begründen, dass die aktive Molalitat m*q' mit zunehmendem Proteingehalt einer Probe durch Komplexierung verringert wird Gleichzeitig fuhrt aber eine erhöhte Proteinkonzentration nach Gleichung 62zu einem verminderten Wasseranted in der Probe Aufgrund der erhaltenen Resultate wurde versucht, ein gegen Extremwerte robusteres Regressionsmodell anzuwenden [67 68] Dabei werden die Extrema mit einem geringeren Gewichtungsfaktor berücksichtigt Die zugehörigen Daten sind in Tabelle 68 zusammengestellt Tabelle 68 Resultate aus der robusten Regressionsanalyse (Methode nach Huber [68]) nach Gleichung 631 Ionj ß/M CONST 95%Vertrauensbereich 95%Vertrauensbeieich [xlO1] Na+ 322 35 +91 96 0625 +0088 K+ 26 28 ±49 48 0907 +0047 Ca1+ 16 23 ± 937 0966 ±0020 Mg2+ 14 57 ± 492 0955 ±0008 Die Ähnlichkeit der Daten in Tabellen 6 7und 68belegt, dass mit dem robusteren Regressionsverfahren mit Ausnahme tur das Natnumion (geringere Unsicherheit in der Steigung der Regressionsgeraden) keine 90 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN signifikanten Verbesserungengegenüber der Methode der kleinsten Fehlerquadrate erzielt werden können In einem weiteren Schritt wurde untersucht, ob das Modell verbessert werden konnte, indem zusätzliche Parameter in die Betrachtung mit einbezogen wurden Insbesondere war es interessant abzuklären ob das Alter und das Geschlecht des Patienten sowie der medizinische Status einen Einfluss auf das Resultat ausüben Dazu wurde das Modell folgen dermassen erweitert p,HU=CONST +ß(/, ( Probc \ 'J mdL]t +ßSEX SEX +ßJAHR JAHR (o M) V ij J +ßzi Zl +ßZ2 Z2 +ßZ3 Z3 +E, mit ßk Regressionskoeffizienten SEX Indikatorvanable für das Geschlecht (l=mannlich, 2=weibhch) JAHR Jahrgang des Probanden Zn Indikatorvanable für den medizinischen Zustand ZI l=Patienten vor der Dialyse 0=ubnge Z2 l=Patienten nach der Dialyse 0=ubnge Z3 l=Patienten mit Herzbeschwerden 0=ubnge Die Variablen SEX und JAHR wurden mitberucksichtigt, da sich ihre Häufigkeitsverteilungen innerhalb der verschiedenen Probandengruppen stark unterschieden Da die Specimen nicht anaerob abgenommen und gelagert werden konnten, traten Schwankungen im pHWert auf, die keinen Zusammenhang mit dem medizinischen Status des Probanden zeigten Daher wurde fürdie Betrachtung der zweiwertigen Ionen Ca2+ und Mg2+ mit einem pHabhangigen, hohen Anteil an komplexierten 68Abschätzung der Massenkonzentiation von Wasser 91 Kationen im Modell 632 als zusatzliche Variable der pHWert berücksichtigt Anhand des Modells sollten Antworten auf die folgenden Fragen gefunden werden 1 Welche Variablen haben einen signifikanten Einfluss auf das Modell' 2 Lasst sich das Giundmodell nach Gleichung 631 durch Berücksichtigung zusätzlicher Paiametei wesentlich verbessern7 Die Auswahl der signifikanten Koeffizienten erfolgte durch das Verfahren dei Ruckwartsehmination Dabei wurden schrittweise die Variablen, deien Koeffizienten den höchsten PWert (dient als Mass für die statistische Unsicherheit) aufwiesen, aus dem Modell eliminiert Dieser Votgang wurde solange wiederholt, bis sich das Bestimmtheitsmass R1 \on einem Schritt zum nächsten signifikant verschlechterte Die statistische Analyse wurde wiederum mit dem gesamten Datensatz (inklusive Extremwerte) durchgeführt Die entsprechenden Resultate findet man in Tabellen6 9(Methode der kleinsten Fehlerquadrate) und 610 (lobuste Regiession) Signifikanz statistische für 95%Wahrscheinhchkeitsbereichs des ausserhalb liegt ßk h d 05,0> PWerta 3310 0070± 9450 16 ±2 423 961 ± 042 344 ± 42 8 Mg2+ 4200 0650± 9020 19' ±9 678 092± 662 562± 87 2 19 ±2 291 419 ± 65 17 Ca2+ 3420 0260± 9070 15 ±2 723 272± 73 3 02a2± 791 99a 26± 19 26 K+ 4670 0680± 7700 941 ± 114 13 ±2 49 2 821 + 072 61 71± 16 170 Na+ [xlO1] [xlOj [xlO1] [xlO1] [xlO1] B 95%V B 95%V B 95%V B 95%V B 95%V R1 CONST ßpH ßz, ßz: ßz, ß„„, Ionj Vertrauensbereich) B V Bestimmtheitsmass, (R2 326 Gleichung nach Fehlerquadrate) kleinsten der (Methode Regressionsanalyse der aus Resultate 96 Tabelle Signifikanz statistische für 95%Wahrscheinlichkeitsbereichs des ausserhalb liegt ßk dh 005,> PWerta ±0009 0951 209± 294 199a± 184 527 ± 1285 Mg2+ 0070± 0927 1010" + 445 215± 262 275± 354 233± 270 1015 ± 1426 Ca2+ ±0078 0911 ±248 351 279± 483 221a ± 149 8185a± 2143 K+ 0099± 0779 ±215 407 234± 296 195a ± 169 10360 ± 16075 Na+ [xlO'] [xlO1] [xlO1] [xlO1] [xlO1] 95%VB 95%VB 95%VB 95%VB 95%VB CONST ßpH ßz, ßZ2 ßz, Vüm Ionj Vertrauensbereich) (VB: 632 Gleichung nach [68]) Huber nach (Methode Regressionsanalyse robusten der aus Resultate 610: Tabelle 94 KLINISCHE IONEN ANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN Die Variablen SEX und JAHR trugen nicht signifikant zum Modell bei und wurden in allen Fallen eliminiert Gegenüber dem einfachen Modell nach Gleichung 631 erhalt man ein höheres Bestimmtheitsmass (Methode der kleinsten Fehlerquadrate) Man stellt fest, dass die Parameter, die den medizinischen Zustand des Probanden festlegen, ausser im Falle des Mg,+ Ions bei Patienten nach der Hämodialyse, nicht eliminiert werden konnten Dies weist darauf hin, dass der Zusammenhang zwischen dem Quotienten aus ClProbe und fh*q' und der Massenkonzentration von Wasser in der Regel vom Gesundheitszustand des Probanden abhangig ist, auch wenn sich die Koeffizienten ßzl, ßZ2 und ßz1 nicht in allen Fallen signifikant von Null unterscheiden Für die Ca*Ionen wird das Modell für einzelne Individuen zusätzlich durch den pHWert der Probe beeinflusst, allerdings ist der Koeffizient ßpH gesamthaft betrachtet nicht signifikant von Null verschieden Auch beim erweiterten Modell lassensich keine signifikanten Unter¬ schiede zwischen den Resultaten aus der Regressionsmethode der kleinsten Fehlerquadrate und der robusten Regression feststellen Dies deutet darauf hin, dass sich die zugrundeliegenden Daten auch nach der reduzierten Gewichtung der Extremwerte nur teilweise durch einen linearen Zusam¬ menhang erklaren lassen Zusammenfassend kann gesagt werden, dass sichdie einfache Quotienten Methode nach Gleichung 631 zur Abschätzung der Massenkonzentration von Wasser aus dem Verhältnis von experimentellen Werten der totalen Ionenkonzentration zur aktiven Molalität für Na*Ionen in der Praxis nur bedingt eignet Mit Ausnahme von K* unterscheiden sich die Resultate der übrigen Elektrolyte aber nur unwesentlich von denjenigen für Na* Aus diesem Grund kann man festhalten, dass sich das Modell, wie es für Na* bereits angewendet wird, grundsatzlich auch auf andere Ionen übertragen lasst Das höchste Bestimmtheitsmass wurde für die Ionen Na* und Mg2* gefunden 69 Probenbedingte Variationen des Flussigkeitspotentials einer ISE Messkette 95 Für den zur Verfugung stehenden Datensatz konnte keines der ange¬ wandten linearen Regressionsmodelle den Zusammenhang zwischen der Zielvanable p,H,° und der erklärenden Variable (Quotient von c,Probe und m*q') mit einem Bestimmtheitsmass über 05erklaren Extremwerte üben eine grosse Hebelwirkung auf das Modell aus, die auch mit robusteren Regressionsmethoden nicht verhindert werden kann Das Auftreten dieser Extrema durch biologische Einflüsse kann nicht ausgeschlossen werden Aus diesem Grund ist es nicht zulassig, die betroffenen Daten aus dem Regressionsmodell auszuschhessen Mit dem erweiterten Modell nach Gleichung 632 kann ein grosserer Anteil der Zusammenhange beschrieben werden Aus praktischen Gründen kann aber nur mit dem einfachen Modell nach Gleichung 631 gearbeitet werden Die zusatzlich benotigten Parameter für das erweiterte Modell sind in der Praxis üblicherweise nicht verfugbar 69 Probenbedingte Variationen des Flussigkeitspotentials einer ISEMesskette In Kapitel 51wurde eine kurze Einfuhrung in die Funktionsweise der lonenselektiven Elektroden gegeben Dabei wurde darauf hinge¬ wiesen, dass neben dem Membranpotential EM, welches das lonenselektive Verhalten und somit die interessierende Grosse repräsentiert, das Flussig keitspotential E, ebenfalls von der Probenzusammensetzung abhangt E, ist abhangig von der Wahl des Bruckenelektrolyten der Referenzelektrode Mit Hilfe der Gleichung von Henderson (Gl 54) wurde das Flussig keitspotential aus gemessenen freien Ionenkonzentrationen von Natrium, Kalium, Calcium und Magnesium für die individuellen Plasmaproben bei der Verwendung eines 1 mol L 'Kahumchlond Bruckenelektrolyten abgeschätzt Für Anionen wurde das Chlorid in den experimentell bestimmten Mengen berücksichtigt, wahrend Bicarbonat und weitere 96 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN anorganische und organische Anionen naherungsveise durch Acetat ersetzt wurden, da bei der Verwendung von Chlorid als alleinigem Gegenanion zu hohe Potentialwerte erhalten werden Die Wahl fiel auf das Acetat, weil es eine nahezu identische Beweglichkeit zum Bicarbonat aufweist In Abbildung 69 findet man das Flussigkeitspotential aufgetragen in Abhängigkeit der Probandengruppe Es unterscheidet sich für alle pathologischen Falle signifikant von den Werten für gesunde Probanden 0 60 __^ 0 65 | , __^ > I I 1 £ 0 70 —I— I 1| 1 ^ 0 75 , , —'— ' L=^ _L_ 0 80 | "0 85 4 ,,1 1 1 G VD ND HV Abb 69 Nach der Formel von Henderson (Gl 54) experimentellabge¬ schätztes Flussigkeitspotential bei der Verwendung einer 1mol L 'KC1 Losung als Bruckenelektrolyt, gegliedert nach Probandengruppen, T = 37 °C, (Darstellung analog zu Abb 62) v , , Es ist sehr wichtig zu beachten, dass Variationen im Flussigkeitspotential sowohl die Bestimmung von m]q' als auch von cProbet mit lonen ° ij ij selektiven Elektroden gleichermassen beeinflussen Im Gegensatz zu der im Abschnitt 66 diskutierten Problematik handelt es sich hier nicht um einen Einflussfaktor, der von einer mathematischen Datentransformation herrührt, sondern um ein physikalisches Phänomen 69 Probenbedingte Variationen des Flussigkeitspotentials einer ISE Messkette 97 Die Potentialbeitrage Ei wirken sich auf das Resultat einer potentio metnschen Elektrolytbestimmung aus, sofern der Messwert nicht rechnerisch korrigiert wird, oder bei der Kalibration mitberucksichtigt wird Wird mit einem Kalibrator gearbeitet, dessen Elektrolytzusammen¬ setzung den mittleren Aktivitäten (z B Mittelwert für gesunde Probanden) einer physiologischen Probe entspricht, lasst sich der Einfluss des Flussigkeitspotentials auf das Analysenresultat reduzieren Alternativ kann die mit dem Sensor gemessene EMK auch um einen fixen Betrag korrigiert werden, der beispielsweise dem Mittelwert des Flussigkeits¬ potentials in Proben gesunder Probanden entspricht Dennoch treten in beiden Fallen flussigkeitspotentialbedingte Fehler e£) auf, die aus Ab¬ weichungen der Individualwerte einer Probe Eu vom Mittelwert Fj resultieren e'J =10l s * (6 33) sSteigung der Elektrodenfunktion [V] Tabelle 611 gibt eine Übersicht über die zu erwartenden Fehlerbeitrage nach erfolgter Korrektur der Messwerte um einen konstanten Betiag 98 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN Tabelle 611 Mittlere Flussigkeitspotentiale F, für die einzelnen Proban¬ dengruppen Mittlere, relative Fehlerbeitrage E/j ,verursacht durch Va¬ riationen des Flussigkeitspotentials bei der Analyse einwertiger (z=l) und zweiwertiger (z=2) Ionen unter Annahme theoretischer Elektrodenstei gungen, T=37 °C, Bruckenelektrolyt 1mol L'KCl Probanden¬ z, |e£|| K'l gruppe [mV] z=l [%] z=2 [%] Gesunde Mittelwert 0 77 010 020 (n=36) 95%Intervall 0 78 0 76 008 012 016 024 Vor Mittelwert 0 68 033 067 Dialyse (n=18) 95%Intervall 0 71 0 65 023 043 046 088 Nach Mittelwert 0 70 026 052 Dialyse (n=13) 95%Intervall 0 71 0 69 021 031 0 41 063 Herzversagen Mittelwert 0 71 026 0 53 (n=14) 95%Intervall 0 75 0 67 015 037 031 075 Gesamt Mittelwert 0 73 020 041 (n=82) 95%Intervall 0 74 0 72 016 024 034 048 610 Direktmessungen mit optischen Sensoren 99 Die Daten der letzten beiden Kolonnen in Tabelle 611 zeigen, dass sich Fehlerbeitrage, die von der Variation des Flussigkeitspotentials her¬ rühren, zwar durch eine Korrektur minimieren, nicht aber vollständig eliminieren lassen Eine Berücksichtigung der Individualwerte kommt aus Gründen des experimentellen Aufwandes in der Regel nicht in Frage Im allgemeinen kann festgehalten werden, dass im Falle der Elektrolyt¬ analytik mit lonenselektiven, potentiometnschen Sensoren beim Einsatz von konventionellen Referenzelektroden das Flussigkeitspotential eine ge nauigkeitslimitierende Grosse darstellt Dies trifft bei Direktmessungen zu und wirkt sich auf die Bestimmung von m*ql und von c^obef gleichermassen aus Im Falle vom Einsatz der ISE in stark verdünnten, gepufferten Specimen sind hingegen kaum Auswirkungen auf die Resultate von Gesamtkonzentrationsbestimmungen ClProbe zu erwarten 610 Direktmessungen mit optischen Sensoren 610 1Einfluss des pHWertes auf die Messung mit optischen Sensoren Der pHWert der Probe beeinflusst den mit optischen Sensoren erhaltenen Messwert im Falle einer Elektrolytmessung in mehrfacher Hinsicht Zum einen bestimmt der pHWert den Anteil an frei oder komplex gebunden vorliegenden Ionen, da die bestimmenden Kom¬ plexierungsgleichgewichte allesamt pHabhangig sind Diese Tatsache gilt natürlich auch für die Elektrolytanalytik mit potentiometnschen Sensoren und fallt besonders dann ins Gewicht, wenn keine anaerobe Proben¬ entnahme und Behandlung erfolgt In Analogie zu den ISE konnten daher gegebenenfalls die gleichen empirischen Faktoren für die rechnerische Korrektur des Analysenresultates auf einen physiologischen pHWert von 74angewendet werden [61, 62] 100 KLINISCHE IONEN ANALYTIK MIT CHEMISCHENSENSOREN Eine zweite Art der pHAbhängigkeit ist spezifisch für den in dieser Arbeit angewandten Typ von Optoden, wie er in Kapitel 52eingeführt wurde Da die kationenselektiven Austauschoptoden gemäss Gleichungen 514 und 515 stets auf das Verhältnis der Messionenaktivitat und der Protonenaktivitat in der Probe ansprechen, ist für eine exakte Bestimmung der Messionenaktivitat die genaue Kenntnis des pHWertes erforderlich Diese Voraussetzung ist dann erfüllt, wenn der pHWert der Probe entweder konstant und bekannt ist, durch Putferung konstant gehalten wird, oder simultan mitgemessen wird Soll allerdings mit der Optode die aktive Molalität des Analyten in der unverdünnten Probe erfasst werden (Direktmessung), wäre eine Pufferung ohne nennenswerte Verdünnung höchstens durch Zusatz einer geringen Menge einer hoch¬ konzentrierten Pufferlosung realisierbar Ferner konnte gezeigt werden (vgl Abb 610), dass die Annahme eines konstanten pHWertes im Falle von realen Plasmaproben, entnommen unter normalen Laborbedingungen, verworfen werden muss Das Ausmass der Variationen des pHWertes von 4verschiedenen Probandengruppen ist in Abbildung 610 dargestellt 610 Direktmessungen mit optischen Sensoien 101 79 78 _^ —I— | 77 I1 X~ I ^ , , a76p=^ rz 75 74 1 I I I I G VD ND HV Abb 610 Gemessene pH Weite in Plasma gegliedeit nach Piobanden gruppen Bemeikung Keine anaciobe Piobeiibehandlung (Daistellung analog zu Abb 62) Daiaus lassen sich nun mit Gleichungen 514 und 6^4 die pll mdu/ieiten Messtehlei e1'" auf die Messung dci aktnen Molalität in1]1 des al en abschätzen, die untei Annahme eines konstanten pHWeites in det Ptobe eihdlten winden e^"=[Ti;|,(pn)rti;;l(pn1)]/ih;;,(pH1) & u) hui den konslanten pH Weit winde dei Mitlclwcit hu gesunde Piobanden eingesetzt Die Resultatesind in \bbildung b1 I zusaiiimeiigciasst 102 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHFMISCHFN SENSOREN ^ 100 80 60 40 20 a) 300 200 100 (b) XCl d ±1 I I E —1 H 3 C7"T3 VD ND HV 1 i G VD ND i i HV Abb 611 Durch pHVariationen verursachte mittlere relative Messfehler einer lonenselektiven Austauschoptode bei Annahme eines konstanten pH Wertes in der Ptobe tut einwertige Kationen (a) und für zweiwertige Kationen (b) Abbildung 611 belegt, dass beim Einsatz einer kationenselektnen Optode für die Erfassung deraktiven Kationenmolahtat keinesfalls von einem konstanten pH Wert inphysiologischen Proben ausgegangen werden darf Dabei wurden im Falle der zweiwertigen Ionen wie Ca2* und Mg1* Messfehler bis zum Vierfachen desMessresultates erhalten Als Losung für den Direkteinsatz von Optoden in der klinischen Probe bleibt die simultane Miterfassung des pHWertes mit anschliessender rechnerischer Korrektur der gemessenen aktiven Molalitat Dazu können herkömmliche pHElektroden oder auch optische pHSensoren [69 73] eingesetzt werden Wie bei Bakker [30] festgehalten, müssen jedoch sehr hohe Anforderungen an die Genauigkeit der pHMessung gestellt weiden Um bei der Bestimmung der aktiven Molalitat eine Fehlergrenze von 1% nicht zu überschreiten, durfte die pHMessung eine Unsicherheit von höchstens 0004 pHEinheiten (für einwertige Ionen) aufweisen, was mit heutigen Methoden kaum zu erreichen ist 610 Dnektmessungen mit optischen Sensoren 103 Zusammenfassend muss festgestellt werden, dass Direktmessungen in klinischen Proben mit Optoden basierend auf Ionenaustausch nicht die geforderten Erwartungen erfüllen können Nur die Stabilisierung des pH Wertes der Probe in einem sehr engen Bereich wurde die optische Dnekt messung mit zufriedenstellenderSicherheit ermöglichen 610 2Vorversuche zur Messung der freien Ionenkonzentration in Vollblut Ungeachtet der ungelösten Probleme der pHMessung, wurde in einigen Vorexperimenten untersucht, wie sich eine lonenselektive Optodenmembran in Vollblut mit Heparin als Antikoagulans verhalt Als Beispiel wurde ein calciumselektiver Sensor gewählt Dazu wurde die ATRMesstechnik mit einem planaren Reflexionselement in einer Durch flussmesszelle angewendet (siehe Kap 921) Von besonderem Interesse war bei diesen Experimenten die Signalregeneration nach dem Kontakt mit der Vollblutprobe Abbildung 612 zeigt, dass mit dem zur Verfugung stehenden Messaufbau keine zufriedenstellende Regeneration des Mess¬ signals nach dem Blutkontakt erreicht werden konnte Dies musste zumindest teilweise auf die verwendete Messzelle zurückgeführt werden, die sich nicht für den Durchfluss viskoser Proben eignete und die keine vollständige Spulung nach dem Blutkontakt gewährleistete Auch gelang es nicht, wahrend der Messung im Vollblut stabile optische Signale zu erhalten Vielmehr wurde über mehrere Messungen eine Zunahme der Absorption für die Blutprobe beobachtet, obwohl sich der pHWert nicht veränderte 104 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN 114 1121 ?c 1101 m £l 08H co 2 106 c UJ 104 1084 1081 K2 K2 102 H 100 1022 K3 1106 K2 •* Blut ^J 1015 1017 0 20 40 6080 Zeit /min Abb 612 Ansprechverhalten eines optischen ATRCa +Sensors der Membranzusammensetzung M l'(ETH 1001, ETH 5350, NaTFPB, DOS / PVC) in wassrigen Kahbrationslosungen (K2, K3, vgl Abschnitt 93) sowie in Vollblut fs wurden keine weiteren Experimente aul diesem Gebiet durchgeführt Die Vorversuche haben gezeigt, dass im Vergleich zur Arbeit mit verdünnten Proben [li] insbesondere in messtechnischen Belangen grossere Anpassungen an bestehenden Systemen notwendig sind, die über den Rahmen dieser Arbeit hinausgegangen waren Mcmbr in/us immtnsct/ungcn siehe Anh tng I 611 Schlussfolgerungen 105 611 Schlussfolgerungen Am Beispiel eines ausgewählten Kollektivs von 82 Probanden, klassifiziert nach medizinischen Gesichtspunkten, wurde untersucht durch welche Faktoren das Resultat einer klinischen Elektrolytanalyse mit einem chemischen Sensor in der unverdünnten Probe beeinflusst wird Im Vordergrund stand zum einen die Frage, welche Parameter mögliche Fehlerquellen tur verfälschte Resultate darstellen und in welcher Grossenordnung die daraus resultierenden Fehler liegen Zum anderen wurde eine kritische Betrachtung der heute üblichen Praxis zur Verarbeitung eines Sensor Rohsignals in eine klinisch interpretierbare Grosse vorgenommen Bedingt durch die physikalischen Gegebenheiten der Methode treten beim Einsatz von lonenselektiven Elektroden in biologischen Proben Unsicherheiten in der Messung auf, die vom Flussigkeitspotential Es herrühren Diese sind aus messtechnischen Gründen nicht für jede einzelne Probe erfassbar und die verursachtenUnsicherheiten lassen sich daher auch nicht vollständig rechnerisch kompensieren Eine teilweise Korrektur ist möglich und sinnvoll und wid heute bereits in direkt messenden ISE Systemenangewendet Bei der Verwendung von lonenselektiven Optoden ist man hingegen mit einem anderen Problem, bedingt durch die Methode, konfrontiert Die mit einer Optode gemessenen aktiven Molalitaten sind sehr stark vom pH Wert der Probe abhangig Die Annahme eines biologisch regulierten und daher konstanten pHWertes muss verworfen werden Insbesondere bei nicht anaerober Probenbehandlung, wie sie im Spital den Normalfall darstellt, treten pHSchwankungen auf, die eine rechnerische Kom¬ pensation mit einem konstanten Wert verunmoglichen Als Ausweg bleibt die simultane Erfassung des pHWertes in jeder einzelnen Probe Allerdings ist mit der heute verfugbaren Messtechnik eine pHMessung 106 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN mit der erforderlichen Präzision von ± 0004 pHEinheiten nicht ohne weiteres realisierbar, so dass eine nicht kompensierbare Unsicherheit der Methode verbleibt Ferner besteht die Möglichkeit, durch Pufferung der Probe den pHWert konstant zu halten Um aber der Forderung der un¬ verdünnten Probe nachzukommen, durfte dazu nur ein vernachlassigbar kleines Volumen einer hochkonzentrierten Pufferlosung zugesetzt werden Ein positiver Nebeneffekt wäre dabei die Stabilisierung der Ionenstarke, so dass sich die relativ geringen klinischen Variationen nicht mehr in Än¬ derungen der molalen EinzehonenAktivitatskoeffizienten äussern wurden In ersten Experimenten wurde versucht, Ca2+Ionen mit einer Optode direkt in Vollblut zu messen Probleme mit dem Transport der viskosen Blutprobe in den engen Kanälen der ATRDurchflussmesszelle führten dazu, dass sich das optische Signal nach Blutkontakt nicht mehr ohne weiteres regenerierenhess Für weitere Experimente auf diesem Gebiet ist es daher wichtig, mit einem optimierten Messaufbau zu arbeiten Auch ist eine Verkleinerung des Systems zur Reduktion der benotigten Blut¬ menge erforderlich Ein lonenselektiver Sensor kann mit gemischten, wassrigen Elektrolyt¬ losungen auf der Basis von aktiven Molalitaten m*q kalibriert werden Dazu ist die Kenntnis der molalen EinzehonenAktivitatskoeffizienten X, notwendig, die mit der Methode von Pitzer auch in gemischten Elektrolyt¬ losungen mit genügender Zuverlässigkeit abgeschätzt werden können Dies fuhrt unter Berücksichtigung der zuvor genannten Parameter (Flus¬ sigkeitspotential, pHWert) zu Messwerten, die die biologisch relevante aktive Molalität m'q' desIons im wassrigen Anteil der unverdünnten Probe korrekt wiedergeben Der zusatzliche Schritt der rechnerischen Umwandlung der aktiven Molalität in eine freie (molare) Ionenkonzentration clpJrobef oder gar die totale (molare) Ionenkonzentration cProbe birgt aber unnötige Risiken, 611 Schlussfolgerungen 107 wenn diese auf der Basis von gemittelten Umrechnungsfaktoren geschieht Im Rahmen dieser Untersuchungen musste festgestellt werden, dass 17 % (einwertige Ionen), respektive 37 % (zweiwertige Ionen) aller Mess¬ resultate durch den Umrechnungsvorgang in freie Ionenkonzentrationen um mehr als 05% verfälscht werden In dieser Zahl sind die analytischen Fehler verursacht durch die Messmethode selbst (z B Änderungen des Flussigkeitspotentials beim Einsatz von ISE) noch nicht enthalten Probleme treten bei allen Patienten auf, die eine starke Abweichung der Massenkonzentration von Wasser gegenüber normalen Personen zeigen, verursacht durch erhöhte oder reduzierte Protein und Fettwerte im Blut Innerhalb des untersuchten Patientenkollektivs sind besonders Patienten nach erfolgter Hämodialyse oder Patienten mit Herzbeschwerden betroffen Gerade in diesen Fallen wurde die wertvolle Information des SensorMesswertes aufgrund der Interpretation einer molaren Ionen¬ konzentration, basierend auf falschen Annahmen, durch eine Daten¬ umrechnung verloren gehen oder ausgemittelt werden Eine teilweise Transformation des Messwertes zu einer freien Molalität des Ions m^q' unter Verwendung mittlerer molaler EinzehonenAktivitatskoeffizienten wäre für einwertige Ionen vertretbar, wenn auch vom klinischen Standpunkt aus betrachtetnichtsinnvoll Die y zeigen verhältnismässig kleine Variationen und werden vermutlich durch biologische Kontroll¬ mechanismen stark ausgeglichen Für die zweiwertigen Ionen Ca2+ und Mg1+ ist diese Voraussetzung aber nicht erfüllt Stehen in einem Labor zur Erfassung von Elektrolyten sowohl direkt¬ messende (unverdünnte Probe), wie auch indirekt arbeitende (verdünnte Probe) chemische Sensorsysteme oder andere auf Gesamtkonzentrations messung basierende Analysatoren zur Verfugung, bietet sich die Möglichkeit, durch Vergleiche der unabhängigen Messresultate über ein lineares Regressionsmodell Rückschlüsse auf die Massenkonzentration von Wasser anzustellen Dieses Verfahren lasst sich grundsätzlich auf die Kationen Na\ K+, Ca2+ und Mg1+ anwenden Es vermag aber den 108 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN Zusammenhang zwischen der Massenkonzentration von Wasser und dem Quotienten aus c,Probt' und m^' für die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten 82 Individuen in allen Fallen nur mit einem beschrankten Bestimmtheitsmass unterhalb von 05zu beschreiben Berücksichtigt man die gesammelten Tatsachen, gelangt man zum Schluss, dass Resultate aus Messungen mit chemischen Sensoren in unverdünnten biologischen Proben unabhängig von anderen Methoden, beruhend auf Gesamtkonzentrationsmessungen, behandelt und interpretiert werden sollen, um den maximalen Grad an Information aus einer Analyse zu erhalten Dazu ist es aber notwendig in den klinischen Laboratorien eine unvertraute physikalische Grosse mit neuen Referenzintervallen einzu¬ fuhren Man kann darüber diskutieren, welcher Faktor das grossere Risiko darstellt die Umrechnung der Messwerte im Versuch, Resultate aus verschiedenen Messmethoden anzugleichen oder die Einfuhrung einer neuen physikalischen Grosse, deraktiven Molalität m^ mit einem neuen, zugehörigen Referenzintervall Sicher ist, dass mit der zunehmenden Verbreitung von chemischen Sensoren in klinischen Routinelaboratonen diese Diskussion weitergeführt werden muss Auf alle Falle sollte darauf geachtet werden, dass die Anwender von Geraten, welche auf chemischen Sensoren beruhen, über dieses Problem informiert werden und demzufolge genügend sensibilisiert sind Der Nutzer muss sich der Unterschiede zwischen den Messresultaten erhalten mit verschiedenen Methoden bewusst sein Nur dann lasst sich sicherstellen, dass es nicht zu medizinischen Fehlentscheidungen auf Grund falscher Annahmen kommt, wie zum Beispiel im Fall der Pseudohyponatraemie 109 7 Optische Sensoren auf der Basis von NIRFarbstoffen 71 Einführung in die Problemstellung In den vergangenen fahren wurden in der Gruppe von Prof Simon an der ETH Zürich die Grundlagen für verschiedene optische Sensoren, basierend auf weichgemachten PVCFlussigmembranen, entwickelt [74 78] In der Gruppe von PD LI Spichiger [79] wurde damit begonnen, mit miniaturisierten optischen Systemen zu arbeiten Auch wurde die ATR Messtechnik für die optische Sensonk genutzt und Optoden für den Einsatz in verdünnten biologischen Proben charakterisiert [35, 80, 81] Erfahrungen mit ATRMessungen auf planaren optischen Reflexions¬ elementen ermöglichten den Übergang zur MonomodenMesstechnik für die Vermessung von Optodenmembranen Neue Messtechniken wie zum Beispiel die integrierte Optik ermöglichen heute die Miniaturisierung von Optoden und erweitern dadurch das An¬ wendungsgebiet von optischen Sensoren Insbesondere wurden ver¬ schiedene Realisierungsmoglichkeiten für total integrierte optische Sen¬ soren (TIOS), bei welchen sowohl die Lichtquelle wie auch der Detektor aus einem Material gefertigt sind, präsentiert [82, 83] Diese Module eliminieren die Notwendigkeit externer Komponenten sowie deren aufwendige Justierung und gestatten es, kleine, leichte und stabile Mess¬ plattformen zu fertigen Sie bieten sich für die Realisierung eines Sensorarrays auf einem einzigen Chip mit einem hohen Potential zur Serienproduktion an Als Materialien werden zum Beispiel IIIV Halb¬ leiter verwendet Ein besonders leistungsfähiges Material ist die ternare Verbindung AlxGa, xAs, deren Emissionswellenlange im Bereich von 750 bis 870 nm liegt und über die Zusammensetzung abgestimmt werden kann [84] Aus diesem Grund wird für integrierte, optische Messtechniken der nahe Infrarot Spektralbereich (NIR, Wellenlange A > 780 nm) als Wellenlangenbereich bevorzugt Als weitere Vorteile des langwelligen 110 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN Arbeitsbereiches sind die hohe Einkopplungseffizienz des Lichtes in den Wellenleiter und die geringere spektrale Interferenz durch nicht spezifische Absorptionen verursacht durch die Probe selbst zu nennen [85] Das Ziel derArbeit war es, eine Anpassung der bisherigen optischen Sensoren an die Anforderungen moderner Messtechnik vorzunehmen Dazu war in erster Linie der Ersatz der bis anhin verwendeten Chromo¬ ionophore durch Indikatoren, die ihre maximale Absorption im NIR Bereich aufweisen, zu bewerkstelligen Parallel dazu ging es darum, in interdisziplinarer Zusammenarbeit erste Versuche zum Einsatz von Optodenmembranen auf einem integrierten MachZehnderInterferometer als neuartige Messplattform zu demonstrieren In einem ersten Schritt wurde eine Reihe von bekannten NIRabsor bierenden Farbstoffen untersucht Von Interesse waren ausgewählte Beispiele von Polymethin Farbstoffen, insbesondere die Cyanine und die Merocyamne Im Zentrum stand die Frage nach deren Eignung als Chromoionophore in Optodenmembranen von der Art, wie sie im Abschnitt 52 beschrieben wurden Dazu wurden die Farbstoffe in Membranen mit verschiedenen chemischen und physikalischen Eigen¬ schaften und Zusammensetzungen charakterisiert Im weiteren erfolgte dann in Optodenmembransystemen die Charakterisierung einer neuartigen Verbindung Diese Art von Chromophor wurde zunächst im Rahmen der Synthese einer bekannten Substanz isoliert und dann aufgrund seiner speziellen optischen Eigenschaften genauer untersucht Dabei wurde festgestellt, dass sich der Indikator nicht den PolymethinFarbstoffen zuordnen lasst 72 Optische Eigenschaften von Molekülen 72 Optische Eigenschaften von Molekülen Die optischen Eigenschaften von Molekülen und Ionen beruhen auf ihrer Fähigkeit, elektromagnetische Strahlung innerhalb eines bestimmten Wellenlangenbereiches absorbieren zu können Je nach Wellenlange (resp Energie) der absorbierten Strahlung spricht man von nahem Ultraviolett oder Ultraviolett (UV, 10 380 nm), vom sichtbaren Bereich (VIS, 380 780 nm) und von nahem Infrarot (NIR) oder Infrarot (IR, 780 500000 nm) [86] Der Mechanismus der Lichtabsorption ist in den ersten beiden Fallen (UV und VIS) derselbe Wird die Resonanzbedingung für A£ nach Gleichung 7l erfüllt, so kommt es zur Absorption von elektro¬ magnetischer Strahlung der Frequenz v, respektive der Wellenlange A, was zu wellenlangenabhangigen, elektronischen Spektren fuhrt Im Falle des IR reicht jedoch die Energie in der Regel nicht aus, um Elektronen anzuregen In diesem Fall fuhrt die Absorption der Strahlung zur Anregung molekularer Vibrationen AE =hv =— (7 1) A mit A£ Energiedifferenz zwischen 2Energieniveaus [J] h PlanckKonstante [J s] v Frequenz [s '] c Lichtgeschwindigkeit [ms1] A Wellenlange [m] Ein Molekül im angeregten Zustand kann auf verschiedenen Wegen wieder in den Grundzustand zurückkehren Grundsatzlich lasst sich die strahlungsfreie Relaxation von der Relaxation unter Emission von elektro¬ magnetischer Strahlung unterscheiden Im letzteren Fall spricht man von Fluoreszenz oder von Phosphoreszenz 112 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN Eine weitere bedeutsame optische Grosse im Rahmen der Sensonk ist der Brechungsindex Der Brechungsindex und die Absorption von Licht in einem bestimmten Medium sind gemäss den von Kramersund Kronig hergeleiteten Relationen voneinander abhangig [87 88] Dann wird die Dispersion (Brechungsindex) als Realteil und die Absorption als Imaginarted der komplexen Suszeptibditat bezeichnet Mathematisch können die beiden Grossen durch eine FounerTransformation im HilbertRaum ineinander überfuhrt werden [89] Dies gestattet unter bestimmten Voraussetzungen die theoretische Abschätzung von Disper sionsspektren aus gemessenen UV /VISSpektren Für das Verständnis der chromophoren Systeme ist der Zusammenhang zwischen der Struktur und den zugehörigen elektronischen Spektren von Interesse An dieser Stelle sollen deshalb einige historisch besonders wichtige Resultate zur theoretischen Behandlung von elektronischen Spektren zusammengetragen werden Nach Gleichung 71lasst sichdie Wellenlange der Absorption elektro magnetischer Strahlung aus der Energiedifferenz der vom Übergang betroffenen Zustande bestimmen Um also elektronische Spektren eines Moleküls ausgehend von seiner chemischen Struktur verstehen zu können, ist die Kenntnis der Energien der Grundzustande sowie elektronisch angeregter Zustande notwendig Die elektronische Anregungsenergie sowie die Ubergangswahrscheinlichkeit zwischen den Zustanden beeinflussen die Lage und die Intensität der Absorptionsbanden Molekulare Vibrationen im angeregten Zustand sind für die Form der Banden bestimmend Die ersten Versuche zur Interpretation von Absorptionsspektren stutzten sich auf die Tatsache, dass für konjugierte Systeme langwellige Absorptionsbanden beobachtet werden Daraus wurde geschlossen, dass nur Elektronen, die in konjugierten Bindungen involviert sind, berück¬ sichtigt werden müssen Von der theoretischen Seite her betrachtet, war es 72 Optische Eigenschaften von Molekülen 113 die "valence bond" (VB) Theorie, die erstmals Zusammenhange zwischen Absorptionsverhalten und Molekulstruktur von konjugierten Systemen zu erklaren vermochte [90] Die VBTheone verlor ihre Bedeutung mit dem Aufkommen der Molekulorbitaltheone (MO) Als Spezialfall sei hier das von Kuhn im Jahr 1948 entwickelte Modell des Elektronengases (free electron model, FEMO) erwähnt [91] Im einfachsten Fall werden dabei die MO's durch Betrachtung von Elektronen in einem eindimensionalen Kasten erhalten Die Lichtabsorption kommt durch die Anregung eines Elektrons aus dem höchsten besetzten MO (HOMO) in das niedrigste, unbesetzte MO (LUMO), die sog Grenzorbitale zustande Diese Anregung ist verantwortlich für den Übergang niedrigster Energie, in der Regel 7t—>7t* oder n—>tc* (n nichtbindendes Orbital) Damit hessen sich auch für komplexere Moleküle erfolgreiche Abschatzungen vornehmen Das FEMO Modell wurde spater durch die auch heute noch weitverbreitete Methode der Linearkombination von Atomorbitalen (linear combination of atomic orbitals, LCAOMO) und die daraus abgeleitete Huckel Methode (HMO) für 7tElektronensysteme abgelost, die sich beide leichter als Computerprozeduren implementieren hessen Auch in diesen Methoden wird der Elektronenubergang mit geringster Energie¬ differenz zwischen Grenzorbitalen postuliert Der schwerwiegendste Nachteil der HMOMethode ist allerdings die totale Vernachlässigung von ElektronElektron Wechselwirkungen Ferner wird nicht berücksichtigt, dass für die Absorption von elektromagnetischer Strahlung nicht nur die Lage der Energieniveaus des Grundzustandes eines Moleküls von Bedeutung ist, sondern dass auch elektronisch angeregte Zustande eine wichtige Rolle spielen Ferner wird die Energie eines Molekulorbitals nicht nur durch eine einzige Elektronenkonfiguration, wie im HMO und im FEMOModell angenommen, bestimmt Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Elektronenkonfigurationen sind entscheidend Dieser Gedanke bildete den Grundstein für die Entwicklung der sog Pariser 114 OPTISCHE SENSOREN AUFDER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN ParrPople (PPP) Methode [9294] Wechselwirkungen zwischen Elektronen und zwischen verschiedenen Elektronenkonfigurationen (configuration interaction, Cl) werden mitberucksichtigt Weil die Wellenfunktionen verschiedener angeregter Zustande kombiniert werden können, wird jeder elektronische Übergang durch mehrere elektronische Anregungen zwischen besetzten und unbesetzten Orbitalen interpretiert Mit dieser Methode lassen sich recht zuverlässige Voraussagen über die Lage von Absorptionsbanden machen 73 Chromoionophore für Optodenmembranen Wie in Kapitel 52dargestellt, erfolgt die Signalumwandlung von der molekularen Erkennung in eine optisch erfassbare Messgrosse bei den hier betrachteten optischen Sensoren mit Hilfe des Chromoionophors Zu diesem Zweck eignet sich grundsatzlich jede Verbindung, die unter Änderung ihrer optischen Eigenschaften in der Lage ist, eine selektive und reversible Wechselwirkung (Komplexierung, Reaktion) mit einem Analyten einzugehen In Austausch oder Koextraktionssystemen steht der Chromoionophor C in Verbindung mit einem zweiten Ionophor L (siehe auch Abb 52), der in der Regel selbst keinen Beitrag zum optischen Messsignal liefert In allen im folgenden betrachteten Fallen wird für den Chromoionophor ein H+selektiver Ligand (pHIndikator) verwendet, der durch Protonierung oder Deprotonierung seine optischen Eigenschaften verändert Das WasserstoffIon unterscheidet sich chemisch sehr stark von Metalhonen, so dass in der Regel keine Selektivitatsprobleme anzutreffen sind In Austauschsystemen erfolgt ein Austausch von Protonen gegen Kationen aus der Probe unter Beibehaltung der Elektroneutrahtat der 73Chromoionophore für Optodenmembranen 115 Membran Nur der Chromoionophor ändert bei diesem Vorgang seine optischen Eigenschaften Im folgenden sollen die Anforderungen an einen Chromoionophor für Optoden basierendauf Ionenaustausch oder Ionenkoextraktion etwas detaillierter beleuchtet werden Der ideale Chromoionophor sollte für die oben genannten Anwendungen möglichst viele der unten aufgelisteten Bedingungen erfüllen pHgekoppelte optische Eigenschaften Hohe Selektivität für Protonen gegenüber anderen Metallkationen An die Stabihtatskonstante des IonophorAnalytKomplexes und die Probe angepasste Basizitat, um die Reversibilität zu gewahrleisten An das verwendete Messsystem angepasster Wellenlangenbereich, in dem die optischen Eigenschaften messbar sind Photochemische Stabilität im Hinblick auf eine lange Lebensdauer der Sensormembran Hohe Lipophihe um eine gute Loslichkeit in der organischen Membranphase zu garantieren und somit ein Auswaschen in die wassnge Probephase zu verhindern oder Möglichkeit zur Immobilisierung (kovalent, ionisch) an die Membranmatiix Genugende Mobilität in der Membranphase, um die Ansprechzeiten des Sensors kurz zu halten Die hier aufgelisteten Anforderungen sind unabhängig von dem gewählten Messmodus für den optischen Sensor Im folgenden wurden aber im Rahmen dieser Arbeit alle Farbstoffe im Absorptionsmodus charakterisiert Auf Fluoreszenzfarbstoffe wird deshalb nicht weiter eingegangen 116 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN Als besonders kritisch für die Eignung als Chromoionophor erweist sich die Basizitat des Indikators Wie aus Gleichung 59ersichtlich ist, geht die Aciditatskonstante Ä"a des Chromoionophors in der Membranphase in die Austauschkonstante Kex'h ein Zusammen mit dem pHWert der Probelosung wird somit der dynamische Ansprechbereich des Sensors festgelegt In Abbildung 71ist als Beispiel der Einfluss der Basizitat des Chromoionophors auf den Messbereich einer Ca+selektiven Optode im physiologischen pHBereich, berechnet nach Gleichungen 59 und 514, dargestellt 08 06 04 02 12 10 8 6 4 '09 (aCa**) 0 Abb 71 Berechnete Ansprechkurven einer Ca2+Optode mit lonophor ETH 1001 [78] bei der Verwendung von Chromoionophoren mit unter¬ schiedlicher Basizitat in einer Probelosung mit pH 760 (+) ETH 5294 (pK=12 0), (O) ETH 5350 (pK =13 4) und (D) ETH 2430 (pK =13 7) [32] Der Ausdruck 1a beschreibt den Protonierungsgrad des Chromoionophors (siehe Gl 513) 73Chtomoionophore für Optodenmembranen 117 Die Wahl des Indikatorserlaubt demzufolge eine flexible Anpassung des Messbereichs an die zu untersuchende Probe, solange die Auswahl zwischen Chromoionophoren verschiedener Basizitat besteht Als Alter¬ native besteht die Möglichkeit den pH Wert durch Pufferung anzupassen Allerdings werden dem pHBereich durch die Eigenschaften des Analyten oft enge Grenzen gesetzt (z B Ausfallung des Analytkations mit Hydroxidionen) Schliesslich lasst sichdie Austauschkonstante Kex*h noch durch die Wahl eines Liganden mit unterschiedlicher Brutto¬ stabihtatskonstante ßlL verandern Aus Gründen der Selektivität ist dies allerdings nur sehr selten realisierbar, da in der Regel nicht verschiedene Liganden mit optimierter Selektivität für den Analyten zur Verfugung stehen Die Basizitat des Chromoionophors ist also auf jeden Fall sehr wichtig Mit bekannten Aciditatskonstanten für die Chromoionophore K^ und den Austauschkonstanten KeJh für ein bekanntes Optodensystem, lassen sich nach Gleichung 59 die Austauschkonstanten für Chromoionophore mit beliebiger Basizitat abschätzen Daraus wiederum, erhalt man nach Gleichung 514 die theoretischen Ansprechfunktionen der Optoden Das erlaubt es, den in Abbildung 72dargestellten pHBereich zu ermitteln, in dem die Kationen Na+, K+ und Ca1+ in physiologischen Konzentrationen erfasst werden können Der Messbereich wurde so angegeben, dass die mittlere physiologische freie Ionenkonzentration des jeweiligen Ions (in der unverdünnten Probe) innerhalbdes linearen Ansprechbereichs des optischen Sensors liegt und mit maximaler Empfindlichkeit erfasst werden kann Als Grundlage für die Berechnung dienten die Kenngrossen von bekannten KationentauscherOptoden fürdie betrachteten Ionen, die in der Gruppe von Prof W Simon entwickelt worden waren [31, 78, 95] 118 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIRFARBSTOFFEN 9i 8 7 «D 6 O 3 2 1 46 8 10 12 14 pKg (Chromoionophor) Abb 72: Möglicher Messbereich (pH) in Abhängigkeit des pKaWertes des Chromoionophors für die Erfassung von Ca2+ (lonophor: ETH 1001), Na+ (lonophor: ETH 4120) und K+ (lonophor: Valinomycin) in physio¬ logischen Konzentrationen (freie Ionenkonzentrationen) mit einer Optode Im speziellen markiert der horizontale Balken den physiologischen pH Wert von 74, der für Direktmessungen relevant ist Bis heute werden als Chromoionophore für Optoden basierend auf Ab¬ sorptionsmessungen in vielen Fällen Derivate des basischen Benzo phenoxazinFarbstoffs Nilblau eingesetzt (vgl Abb 74) Diese wurden in der Gruppe von Prof Simon entwickelt [32] Die einzelnen Chromo¬ ionophore unterscheiden sich lediglich sowohl im Aufbau als auch in der Länge ihrer Seitenketten am IminStickstoff Aus diesem Grund liegen auch die Absorptionsmaxima in einem relativ engen spektralen Bereich von 600 bis 650 nm fürdie protonierten Spezies und 500 bis 550 nm für 74NIRabsorbierende Farbstoffe 119 die deprotonierten Spezies (gemessen in Methanol) [32] Die Seitenkette beeinflusst das Absorptionsverhalten nur marginal, da sie in den meisten Fallen keine chromophoren Gruppen enthalt, die in Resonanz¬ wechselwirkung mit dem nElektronensystem des Farbstoffgrundgerustes stehen Hingegen übt die Seitenkette einen Einfluss auf die Lipophihe und die Basizitat des Farbstoffes aus Die pKaWerte für die Nilblaudenvate liegen in DOSweichgemachten PVCMembranen zwischen 9 0 und 14 0 Der grosse Basizitatsbereich der Indikatoren gestattet eine flexible Anpassung des Sensorarbeitsbereichs an die Probe Für die Entwicklung von neuartigen Chromoionophoren wäre es aus diesem Grund ein grosser Vorteil, wenn ausgehend von einem Grund gerust, das den Chromophoren enthalt, in Analogie zu den Nilblau denvaten durch flexible Variation von Seitenketten die Basizitat resp Aciditat der Verbindung kontrolliert werden konnte 74 NIRabsorbierende Farbstoffe 741Allgemeines In einer ersten Phase wurde nach Farbstoffen gesucht, die ihr Absorptionsverhalten im NIRSpektralbereich in Abhängigkeit des pH Wertes der Umgebung verandern Zunächst wurden bekannte Verbin¬ dungen mit einem Absorptionsmaximum im NIRBereich erfasst Dazu standen verschiedene StandardLiteraturwerke zu den Themen Farbstoffe, Indikatoren und Laserfarbstoffe zur Verfugung [96 101] Da die Ab sorpüonsmaxima dieser Verbindungen ausserhalb des für das menschliche Auge sichtbaren Bereichs liegen, begann sich die Forschung erst in jüngerer Zeit mit den NIRFarbstoffen zu beschäftigen Für die Anwendung in der klassischen Farbstoffchemie (Textdfarbung, Indi¬ katoren, Farbreagenzien etc) waren diese Substanzen nicht interessant 120 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN Erst mit dem Aufkommen der modernen Farbphotographie, der Laser¬ technik, der optischen Speichermedien sowie der Farblaserdrucker und kopierer begann das Interesse an dieser Klasse von Farbstoffen zu steigen [102 105] Noch spater begann man sich aus der Sicht der analytischen Chemie mit NIRChromophoren zu beschäftigen, wie die folgenden Literaturstellen zeigen [106112] Aus diesem Grund ist es nicht erstaunlich, dass es bis heutekeine kommerziell erhältlichen NIRpH Indikatoren gibt, obwohl die Forschung auf diesem Gebiet, stimuliert durch Entwicklungen auf dem Gebiet der Sensoitechnologte, einen Aufschwung erlebt hat 742 PolymetfnnFarbstoffe Die wohl bekanntesten im NIRBereich absorbierenden Farbstoffe gehören der Klasse der Polymethine an Sie zeichnen sich durch eine zusammenhangende Kette von Methingruppen (CH=), dh durch ein System von konjugierten Doppelbindungen aus Im Gegensatz zu den Polyenen, endet im Falle der Polymethine die Kette konjugierter Doppel¬ bindungen mit einem Elektronendonor und einem Elektronenakzeptor, die beide die notwendigen Energiequanten zur elektronischen Anregung des Moleküls beeinflussen Ferner weisen die Polymethine im Kontrast zu den Polyenen gleiche Bindungslangen über alle konjugierten Bindungen auf Die PolymethinFarbstoffe lassen sich in folgende Untergruppen aufgliedern (vgl Tabelle 71) [99, 113] 74NIR absorbierende Farbstoffe 121 Tabelle 71 Untergruppen von PolymethinFarbstoffen und deren allgemeine Darstellung Gruppe Allgemeine Formel Cyanin Hemicyanin Streptocyanin Oxonol Merocyanin Ein PolymethinFarbstoff mit N 7tZentren (N ist immer ungeradzahlig) entlang der konjugierten Kette enthalt somit N2 Methinzentren und N+l 7tElektronen Die ungeradzahlige Anzahl an Zentren im 7tSystem hat zur Folge, dass das höchste besetzte Molekulorbital ein nichtbindendes Orbital (nOrbital) ist Dadurch weist das HOMO für einen PolymethinFarbstoff eine höhere Energie auf, als in einem Chromophor von ahnlicher Grosse, aber mit geradzahliger Anzahl konjugierter Zentren Die Folge davon ist 122 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN eine geringere Energiedifferenz zwischen HOMO und LUMO (n—>n*) und damit eine langwelligere Absorptionsbande Die scharfe Form der Absorptionsbanden lasst sich durch die geringe Änderung der Bindungslange bei der Anregung erklaren [114] Die Absorptions wellenlange nimmt mit zunehmender Anzahl an CCDoppelbindungen zu Für symmetrische Polymethine kann als Faustregel von einer batho chromen Verschiebung von 100 nm pro zusätzliche Doppelbindung ausgegangen werden, weshalb man von der sogenannten "Vinylen Verschiebung" spricht Durch Substitution von Methingruppen innerhalb der Kette konjugierter Doppelbindungen oder durch das Einfuhren von externen Substituenten an den Methingruppen lassen sich spektrale Verschiebungen der intensivsten Absorptionsbande realisieren, wie durch Storungsrechnung gezeigt werden konnte [115] Die Auswirkungen auf die Absorptionsspektren sind in Abbildung 73dargestellt [113] 1 2 3 X— CH — CH — CH — — CH — X Subst von CH durch Heteroatom Element höherer Elektroneg bath hyps bath Element geringerer Elektroneg hyps bath hyps Externe Seitenkette Akzeptor bath hyps bath Donor hyps bath hyps Abb 73 Einfluss von Substituenten auf die spektralen Eigenschaften von PolymethinFarbstoffen 74NIR absorbierende Farbstoffe 123 Es ist zu beachten, dass auch die bisher als Chromoionophore verwen¬ deten Nilblauderivate formal den PolymethinFarbstoffen zugerechnet werden können, da sie einen PolymethinSubchromophor enthalten, wie in Abbildung 74dargestellt ist Abb 74 PolymethinSub¬ chromophor innerhalb des Nilblaumolekuls 11 (N) jt Zentren, 12 (N+l) n Elektronen, 9 (N2) "Methinzentren" In der Tat können beinahe alle wahrend dieser Arbeit verwendeten NIR Farbstoffe formal der Klasse der Polymethine zugeordnet werden Die Ausnahme bilden die in Kapitel 77 beschriebenen reduzierten DicyanovinylFarbstoffe, die einer eigenen, neuen Farbstoffklasse angehören Neben der Anzahl an konjugierten Doppelbindungen, sind es die Eigen schatten der Donor und Akzeptorgruppen, die das Absorptionsverhalten der Polymethine bestimmen In der Regel können aus Gründen der Stabilität sowie der zunehmenden Tendenz zur cistrans Isomensierung oder zur Aggregatbddung, die konjugierten Ketten nicht beliebig verlängert werden, um die Lage der Absorptionsbanden in den NIR Bereich zu verschieben Als Alternativen bleiben die interne und externe Substitution der Methinzentren (vgl Abb 73) und die Verstärkung des DonorEffektes von elektronenspendenden Gruppen und des Akzeptor Effektes von elektronenziehenden Gruppen Als zwei ausgewählte Beispiele für besonders effiziente, elektrisch neutrale Elektronen Akzeptoren seien hier die mehrfach Cyanosubstituierten Systeme 124 OPTISCHE SENSOREN AUFDER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN (Abb 75 A) genannt (vgl auch Kapitel 76) Auf der Seite der ElektronenDonoren wird das DihydropenmidinSystem (Abb 75B) als ein Beispiel aufgeführt (vgl Kapitel 76) A Abb 75 Zwei Beispiele für (B) 75 Cyanine und Streptocyanine als Chromoionophore 751Ausgangslage In Abbildung 76 findet man die Konstitutionen von 3 ver¬ schiedenen, typischen Cyanin Farbstoffen, die alle in der Literatur bereits beschrieben sind Die Verbindungen IR125 (A) und HITC+ (B) sind als Farbstoffe für den Einsatz in Farbstofflasern auf dem Markt, wahrend die Verbindung pHCOOH+ (C) von Patonay und Mitarbeitern beschrieben wurde [116] Im weiteren findet man die Molekulstrukturen von zwei ebenfalls bekannten StreptocyamnFarbstoffen Es handelt sich um den Farbstoff PDC+ (D) [117, 118] sowie den CroconiumFarbstoff (E) [119 120] Die vollständigen Namen der Verbindungen findet man in Kapitel 96 B effiziente Akzeptor (A) und Donorsysteme 75Cyanine und Streptocyanine als Chromoionophore 125 S03Na S03 Abb 76: Untersuchte CyaninFarbstoffe: A IR125; B HITC+ und C pHCOOH+ sowie StreptocyaninVerbindungen D PDC+ und E CroconiumFarbstoff 126 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIRFARBSTOFFEN Mit Ausnahme der Verbindungen A und E handelt es sich in allen Fällen um kationische Farbstoffe, die als Salze mit einem zusätzlichen Anion vorliegen IR125 (A) und der CroconiumFarbstoff (E) dagegen, liegen als Zwitterion gesamthaft elektrisch neutral vor Diese Tatsache ist von Bedeutung, da die Löslichkeit der Substanzen in apolaren Medien dadurch beeinflusst wird Tabelle 72 gibt eine Zusammenstellung der optischen Eigenschaften der Farbstoffe AE in Lösung Tabelle 72: OptischeEigenschaften (Wellenlänge maximaler Absorption Ämax, molarer dekadischer Extinktionskoeffizient £max) von Cyanin und StreptocyaninFarbstoffen in Lösung1 Farbstoff IR125 HITC+ pHCOOH+ PDC+ Croconium (A) (B) (C) (D) (E) Amax 787a 743a 802" 786a 820a [nm] emax 192000a 247000a 143000" 102000a nb1 [L mol' cm '] aLösungsmittel: Ethanol hLösungsmittel: Methanol 'nicht bestimmt; ungenügende Stabilität Es stellte sichdie Frage, inwiefern diese Farbstoffe als pHIndikatoren eingesetzt werden können und wo ihre pKaWerte liegen Herz charak¬ terisierte eine Reihe von symmetrischen CyaninFarbstoffen mittels spektrophotometrischer pHTitrationen in Wasser und untersuchte die 1Die Angaben beliehen sich auf die intensivste Absorptionsbande unabhängig davon, inwelchem Protonierungszusland der Indikator vorliegt 75Cyanine und Streptocyanine als Chromoionophore 127 Einflüsse von Methinkettenlange und Substituenten auf die Aciditat der Indikatoren [121] Mazzucato, Scheibe und andere Autoren stellten fest, dass die pHAbhängigkeit der Absorptionsspektren von Verbindungen wie A, B und D durch einen Unterbiuch der Resonanz über das konjugierte 7tSystem entlang der Methinkette verursacht wird Dieser Unterbruch wird verursacht durch Protonierung eines Stickstoffzentrums oder eines Methinzentrums [122 127], was zu einem Verlust der langwelligen Absorptionsbande fuhrt In Analogie kann auch ein nukleophiler Angriff des OH Ions im stark alkalischen Milieu zu einem Unterbruch des konjugierten 71Systems fuhren, wie beispielsweise in [128] postuliert wird Die Farbstoffe C und E weisen zusatzliche acide, respektive basische Gruppen auf, die den pKa der Indikatoren bestimmen und die spektralen Eigenschaften über das konjugierte nSystem des Farbstoffs beeinflussen Grummt et al zweifelten diese Erklärung für den Indikator C allerdings an, mit der Begründung, dass der beobachtete Effekt auf die Absorptionsspektren zu stark sei, um alleine vom protolytischen Einfluss auf die endstandigen Carboxylatgruppen herzurühren [129] 752 Stabilität der Farbstoffe Eine wichtige Voraussetzung für die Eignung eines Farbstoffs als Chromoionophor ist seine Stabilität Rasches Ausbleichen durch Lichtein Strahlung oder hohe chemische Empfindlichkeit gegenüber einer che¬ mischen Spezies schranken den Nutzen der Verbindung stark ein Zur Abklärung wurde die Reversibilität von Protonierung und Depro¬ tonierung derIndikatoren sowie die Signalstabditat in alkoholischer Losung und in verschiedenen Membranzusammensetzungen spektros¬ kopisch untersucht Dabei musste festgestellt werden, dass lediglich die Verbindung PDC+ (D) die gestellten Anforderungen zu erfüllen ver¬ mochte In diesem Fall konnten in methanohschen Pufferlosungen über einen weiten pHBereich (mit Ausnahme des stark alkalischen Bereiches) 128 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIRFARBSTOFFEN stabile, optischeSignale beobachtet werden Für den Indikator pHCOOH+ (C) wurden im neutralen und alkalischen Bereich stabile Signale beobachtet, bei tieferen pHWerten (< pH 40) jedoch, erfolgte eine rasche Abnahme der Absorptionsbande im NIRSpektralbereich Eine chemische Reaktion des Farbstoffes mit Komponenten der methanolischen Puffer¬ lösungen im sauren Bereich konnte nicht ausgeschlossen werden Eine saurekatalysierte Veresterung der Carbonsaurereste schien möglich In wassrigen Pufferlösungen wurden keine vergleichbaren Signalverluste im sauren Bereich festgestellt Die chemische Stabilität des Indikators war also sehr stark von der chemischen Umgebung abhangig Allgemein kann festgehalten werden, dass das Vorhandensein von reaktiven funktionellen Gruppen im Farbstoffmolekul die Gefahr der unerwünschten chemischen Umwandlung durch Reaktion mit Puffer oder Membrankomponenten erhöht Für die übrigen Farbstoffe dieser Gruppe wurden jeweils Signal¬ verluste oder nur ungenügende Reversibilität bei wiederholter Protonierung oder Deprotonierung beobachtet Ein Grund für das beobachtete Verhalten der Indikatoren A und B konnte die bekannte Abnahme der Stabilität mit Zunahme der Lange der Methinketten sein, wie sie von Gnffiths beschrieben wurde [105] Der CroconiumFarbstoff (E) zeigte bei Kontakt mit Lauge in ethanolischer Losung oder in einer weichgemachten PVCMembran einen irreversiblen Verlust der NIR Absorption bei gleichzeitigem Auftreten eines neuen Absorptionspeaks im sichtbaren Bereich Aufgrund der gemachten Beobachtungen zur Stabilität, sowie zusätzlichen Problemen wie geringer Loslichkeit, wurde entschieden, die Verbindungen A, B und E im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter zu charakterisieren 75 Cyanine und Streptocyanine als Chromoionophore 129 75 3 Geeignete Membranmedien Aufgrund ihres kationischen Charakters hessen sich die Indikatoren A, B, Cund D nicht muhelos in weichgemachten PVCMembranen losen Daher wurden andere Polymere, die bisher nicht für den in Kapitel 52 beschriebenen Typ von optischen Sensoren verwendet wurden, in die Untersuchungen miteinbezogen Es war offensichtlich, dass für die geladenen Farbstotfmolekule Membranmedien mit relativ hoher Polarität notwendig sein wurden, um eine genugende Loslichkeit zu erhalten Bei der Verwendung von weichgemachten PVCMembranen lasst sich die Polarität der resultierenden Sensorschicht durch die Wahl des Weich¬ machers beeinflussen [130] Für eine Erhöhung der Polarität der Polymermatrix selbst wurde schon in anderen Arbeiten partiell hydroxyhertes PVC (OHPVC) eingesetzt [131] Dadurch blieben die meisten Eigenschaften des Poly(vinylchlond)Systems unter gleichzeitiger Erhöhung der Membranpolantat erhalten Zusatzlich bleibt die Möglichkeit der Wahl verschiedener Weichmacher In seltenen Fallen wurde auch die Verwendung von AminoPVC (PVCNH,) als Matrix für Flussigmembranen beschrieben Aufgrund der freien Aminogruppe kann diese Matrix je nach pHWert als neutrales oder kationisches Polymer betrachtet werden Es zeigt in Abhängigkeit des Weichmachers in einem pHBereich zwischen 4und 11 eine lineare potentiometnsche Ansprech¬ funktion gegenüber Protonen [132] Noch einen Schritt weiter geht die Vei wendung von Polymeren, die über den gesamten interessierenden pH Bereich elektrisch geladen vorliegen Dazu zahlt beispielsweise auch das in Ionentauschermembranen eingesetzte Polymer mit dem Handelsnamen Nafion Es handelt sich dabei um ein perfluorosulfoniertes Polymer Die chemische Struktur ist in Abbildung 77wiedergegeben Der Gehalt an Sulfonsaureresten, der die Anzahl ionischer Ladungen im Polymer festlegt, wurde mittels Titration zu 09mmol SOj /gPolymer bestimmt [133] Ein Nachteil dieses Materials ist die geringe Loslichkeit in den 130 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIRFARBSTOFFEN meisten Losungsmitteln Daherwerden in der Regel im Handel gebrauchsfertige Membranen oder mit speziellen Verfahren hergestellte Losungen angeboten, die jedoch den Anwendungsrahmen sehr einschranken Abb 77 Chemische Struktur des perfluorosulfonierten Polymers Nafion [133] [(CF2CF2)mCFCF2]n f2 CFCF3 O I CF2CF2S03H 754 pHempfindliche Optoden basierend auf NafionMembranen Die Verwendung des IonentauscherPolymers Nafion kombiniert ein sehr polares Membranmedium mit immobilisierten anionischen Zentren Dadurch kann zum einen die Loslichkeit kationischer Farbstoffe durch Bildung von Ionenpaaren verbessert werden Zum anderen steht ein Kationentauscher in der Membranphase zur Verfugung, der es gestattet, Optoden beruhend auf dem Ionenaustauschpnnzip zu realisieren Es wurde dadurch möglich, optische Sensormembranen basierend auf kationischen pHIndikatoren, die reproduzierbar und reversibel auf pH Anderungen der Probelosung ansprechen, zu realisieren Patonay und Mitarbeiter beschreiben einen pHSensor aus Nafion mit pHCOOH+ (C) als immobilisiertem pHIndikator [69] In dieser Arbeit wurde das gleiche Prinzip neben pHCOOH+ auf den Farbstoff PDC+ (D) angewendet und in ein optisches Durchflusssystem implementiert [133] Dies gestattete die Untersuchung des Ansprechverhaltens und der Stabilität des Systems bei 75 Cyanine und Streptocyanine als Chromoionophore 131 kontinuierlichem Betneb Auch konnten die Signalverluste durch Aus¬ waschen der Indikatoren erfasst werden Für beide untersuchten Farb¬ stoffe traten keinerlei Loshchkeitsprobleme in der polaren NafionUmge bung auf Die resultierenden Membranen waren auch nach dem Ver¬ dunsten des Losungsmittels vollständig transparent Abbildung 78 zeigt die Absorptionsspektren, die mit einem Sensor mit PDC+ (D) als Chromoionophor in Nafion aufgenommen wurden Abb 78 Absorptionsspektren einer NafionOptode der Zusammen¬ setzung M21 (Durchflusssystem) mit Chromoionophor PDC+ in Ab¬ hängigkeit des pHWertes der Probelosung (Acetat und Phosphatpuffer) 1Membranzusammensetzungen siehe Anhang 1 132 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN Der zugrundeliegende Ionenaustauschprozess kann schematisch folgender massen dargestellt werden PDC +(mem) +I+(mem) +2RSOJ(mem) +H+(aq) * W PDCH2+(mem) +2RSO^mem)!I +(aq) (7 2) Die Ansprechgeschwindigkeit für eine 95% Signalanderung (t,,4) betrug bei kontinuierlichem Probewechsel in der Durchflusszelle (27 ± 3) sfür eine vollständige Deprotonierung (n=6, 95%, Wechsel von 001 mol L ' HCl zu 014 mol L 'Phosphatpuffer pH 70) und (104 ± 11) sfür eine vollständige Protonierung (n=6, 95%, Wechsel zu 001 mol L 'HCl) Die beobachtete Hysterese in der Ansprechgeschwindigkeit wurde erwartet und lasst sich durch die hohe Pufferkapazitat des verwendeten Phosphat¬ puffers im Vergleich zur verdünnten Saure begründen Für die eingesetzte Sensormembran wurden mit dem Indikator PDC+ nur geringe Signalverluste durch Auswaschen des Chromoionophors aus der Membranphase in die wassrige Probe beobachtet Dies äusserte sich in einer hohen Signalstabilitat und Reproduzierbarkeit bei wiederholtem Wechsel vom protonierten in den deprotonierten Zustand des Indikators, wie in Abbildung 79 dargestellt ist 75 Cyanine und Streptocyanine als Chromoionophore 133 20, E15'coCON 11 0 g c XLU 05 00^ U o Puffer pH 70 Tag 1 n U 001 mol L u u HCl u u 50 100 Zeit /min Tag 2 n 150 Abb 79 Kurzzeitreproduzierbarkeit einer NafionOptode der Zusam mensetzung M2 mit PDC+ als Chromoionophor (vgl Abb 78), aufge¬ nommen bei 780 nm an zwei aufeinanderfolgenden Tagen, verwendete Pufferlösung 014 mol L'Phosphatpuffer Im Falle des Einsatzes von pHCOOH+ als Indikator wurden wesentlich weniger stabile Signale beobachtet Die Signalverluste waren beim Spulen mit verdünnter Saure (0 Ol mol L 'HCl) am stärksten In Abbildung 710 sind die Ansprechfunktionen für zwei verschiedene NafionOptoden dargestellt, wie sie mit den Indikatoren pHCOOH+ (C) und PDC+ (D) realisiert wurden Es wurde eine pHunabhängige Auftragung der Resultate gewählt Daraus hessen sich die scheinbaren pKaWerte (pH Wert für 50 % Protonierungsgrad) der Chromoionophore im Nafion Membransystem bestimmen 134 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIRFARBSTOFFEN =^r A—a —a ^^ o o o ^g? 1 1 11 1 1 1 02 4 6 8 10 12 14 log (aNa+ /aH+) Abb 710 Kalibrationskurven von NafionOptoden mit Chromoionophor D (O, M2) und C (A, M3) Experimentelle Messdaten (0,A) sowie angepasste sigmoidale Kahbrationsfunktion (—) Für den StreptocyaninIndikator PDC+ fand man einen scheinbaren pKa Wert von 45und für den CyaninIndikator pHCOOH+ einen pKaWert von 13 0im verwendeten Sensorsystem für einen NaMonenhintergrund von log a =1 5 Für die mathematische Beschreibung der Kahbrationsfunktion (ausgezogene Linie in Abb 710) wurde eine allgemeine sigmoidale Funktion der Form y=1/(l +e") an die Messdaten angepasst Da es sich bei Nafion um einen Kationentauscher handelt, muss der Einfluss von Alkalnonen auf das optische Signal beachtet werden Die ermittelte scheinbare Aciditatskonstante ist daher möglicherweise vom Na+Gehalt abhangig In der Literatur findet man die folgende Reihe der Iu 08 aCOi_O)«06c o 04i o 02 OO 75 Cyanine und Streptocyanine als Chromoionophore 135 Assoziationskonstanten für Nafion mit Alkaliionen und Protonen in wassriger Umgebung K+>Na+>H+>Li+ [134] Dies bedeutet, dass die in physiologischen Proben vorliegenden Alkaliionen Kalium und Natrium starker an Nafion gebunden werden als Protonen Falls diese Tatsache das Protonierungsgleichgewicht des Indikators beeinflussen wurde, wäre der praktische Nutzen des Sensors sehr beschrankt Patonay et al führten Untersuchungen von K+, Na+ und Li+Interferenzen auf das Verhalten des Indikators pHCOOH+ in Nafion durch [69] Dabei wurde keine signifikante Verfälschung der pHBestimmung festgestellt, solange der Indikator im Absorptionsmodus vermessen wurde Fluoreszenzmessungen hingegen, zeigten eine Querempfindlichkeit gegenüber Lithiumionen Eigene Experimente belegten, dass bei der Verwendung von PDC+ als Chromoionophor in NafionSchichten sehr geringe, reversible spektrale Änderungen des NIRSignals, verursacht durch Kahumionen in sauren Losungen (0 01 mol L'KCl in 001 mol L 'HCl), zu beobachten waren, die vom Verlauf her einer Deprotonierung des Indikators entsprachen Der Farbstoff selbst zeigte aber in ethanohscher Losung keine Empfindlichkeit gegenüber den Natrium und Kahumionen Damit konnte eine direkte Wechselwirkung zwischen Chromoionophor und Alkaliionen ausgeschlossen werden Die leichte Signalzunahme im NIRBereich kann daherdurch eine erleichterte Deprotonierung des Indikators infolge bevorzugter Aufnahme von Kahumionen in die NationStruktur erklart werden Für Natriumionen war der gleiche Effekt in noch geringerem Ausmass zu beobachten Eine wesentliche Störung der pH Messung durch Alkaliionen, vorliegend in geringen Konzentrationen (< 001 mol L '), ist also nicht zu erwarten Im weiteren Verlauf der Arbeiten stellte man fest, dass aufgrund des ionischen Charakters und der damit verbundenen hohen Polarität des Membranmediums sich keine der bekannten Ionophore für die Realisierung einer lonenselektiven Optode mit Nafion kombinieren lassen 136 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN Diese Aussage trifft auf alle Liganden zu, die im Hinblick auf die Loslichkeit in apolarer, hochlipophiler Umgebung optimiert wurden Zusätzlich muss bedacht werden, dass der hohe Uberschuss an negativ geladenen Zentren in Nafion jeglichen Einfluss eines Ionophoren unter¬ drucken wurde und somit zwangsläufig zu einfachenKationentauscher Optoden ohne spezifisches Selektivitatsverhalten fuhren musste 755 Optoden basierend auf PVCMembranen Auf der Basis der vorangehenden Resultate stand fest, dass mit Vorteil nichtionische Polymere verwendet werden, um optische Sensoren im NIRSpektralbereich mit Einbezug der bekannten lonenselektiven Liganden realisieren zu können Aus diesem Grund wurde untersucht, ob die beiden zuvor in Nafion charakterisierten Indikatoren pHCOOH+ und PDC+ sich gegebenenfalls auch in weichgemachten PVC oder Hydroxy PVCMembranen (OHPVC) in Kombination mit einem lonophor ein¬ bringen lassen In Tabelle 73 findet man eine Zusammenstellung über qualitative Eigenschaften wie die Loslichkeit, die pHEmpfindlichkeit und die allgemeine Stabilität der resultierenden Membransysteme durchzufuhren Messungen lonenselektive möglich, nicht war Es werden untersucht Anderungen pH gegenüber Verhalten das nur konnte enthielten, Liganden lonenselektiven einen Membranen die Obwohlc oNPOE Membranen allen in Weichmacherb 1 Anhang siehe Membranzusammensetzung die Füra unlöslich OHPVC pHCOOH+ M7 Membran transparente unempfindlich gut OHPVC PDC+ M6 Signalverluste rasche feststellbar gering PVC pHCOOH+ M5 Signalverluste rasche Membranen transparente reproduzierbar nicht gut PVC PDC+ M4 matrix'' typ1 Membranquahtat pHEmpfindlichkeit" Loshchkeit Membran¬ Farbstoff Membran¬ NafionMembranen nicht in Chromoionophore als StreptocyamnFarbstoffen und Cyanin mit Optodenmembranen von Eigenschaften Qualitative 37 Tabelle 138 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN Die Daten für Membran M6 zeigen, dass der Farbstoff PDC+ gut löslich in der oNPOE weichgemachten OHPVC Matrix war Allerdings konnte keine pH Abhängigkeit der aufgezeichneten Spektren beobachtet werden Im Gegensatz zu Membran M4 mit unsubstituiertem PVC als Matrix, wurden mit M6 auch nach längerem Probendurchfluss optischeSignale mit konstanter Intensität registriert Dies deutet darauf hin, dass die Polantat des Membranmediums für die Herstellung einer stabilen Sensor¬ membran ausreichend ist und das rasche Auswaschen des Chromo¬ ionophors in die Probelosung verhindert werden kann Die fehlende pH Empfindlichkeit eine Protonierung des Indikators in der Membranphase war nicht möglich wurde einer Reduktion des scheinbaren pKaWertes (4 5 in Nafion) gegenüber der wesentlich polareren Umgebung der NafionMembran zugeschrieben Offensichtlich kann die resultierende zweifach positive Ladung des protonierten Farbstoffes PDCH1+ in der hpophileren Membran nicht genügend stabilisiert werdenDer Indikator pHCOOH+ (Membran M7) schien in OHPVC nahezu unlöslich zu sein 756 Schlussfolgerungen Innerhalb der Auswahl der untersuchten Vertreter von Indikatoren aus der Gruppe der Cyanine und Streptocyanine konnte keinFarbstoff gefunden werden, der alle gestellten Anforderungen an einen Chromo¬ ionophor, wie in Kapitel 73zusammengestellt, erfüllen konnte Einfache, pHempfindliche optische Sensormembranen, die im Bereich des nahen Infrarot eingesetzt werden können, wurden unter Verwendung des polaren IonentauscherPolymers Nafion verwirklicht Das Einbringen von neutralen, lonenselektiven Liganden in diese Membranumgebung war jedoch nicht möglich, da diese alle für apolare, hpophile Medien optimiert wurden und sich daher in NafionSchichten ungenügend losen hessen Umgekehrt konnten die meisten Farbstoffe ihrerseits wegen Loshchkeits problemen nicht in weniger polaren Medien eingesetzt werden Mit 75Cyanine und Streptocyanine als Chromoionophore 139 abnehmender Polarität der Membranphase wurde gleichzeitig eine Verminderung der Basizitat der Chromoionophore beobachtet, bis schliesslich sehr tiefe scheinbare pKaWerte gemessen wurden oder eine Protonierung verunmoglicht wurde Eine Erhöhung der Basizitat der Indikatoren wurde nicht in Erwägung gezogen, da damit die potentiell auftretenden Loshchkeitsprobleme im Zusammenhang mit kationischen Farbstoffen nicht eliminiert worden waren Zumindest wäre eine gleichzeitige Lipophdisierung der Farbstoffe unumgänglich gewesen Elektrisch geladene Cyanin oder StreptocyaninFarbstoffe lassen sich nur in Kombination mit polaren oder geladenen Membranmedien einsetzen und sind daher nicht ohne weiteres mit hpophden Ionophoren kombinierbar Für das weitere Vorgehen wurde beschlossen, elektrisch neutrale NIRFarbstoffe vom Typ der Merocyanine oder zwitterionische Verbindungen in Analogie zum CroconiumFarbstoff (E) in den Mittel¬ punkt der Untersuchungen zu stellen 140 OPTISCHE SENSOREN AUFDER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN 76 Merocyanine als Chromoionophore 761Ausgangslage Merocyanine sind ungeladene PolymethinFarbstoffe Es wurde erwartet, dass dadurch Probleme mit der Loslichkeit der Indikatoren in apolarer Membranumgebung, wie sie bei den kationischen Vertretern der Gruppe der Cyanine und der Streptocyanine beobachtet wurden, ver¬ ringert werden können In Abbildung 711 sind die Strukturen der charakterisierten Verbindungen dargestellt Die drei untersuchten Beispiele sind der von der Quadratsaure abgeleitete SquannFarbstoff (F) [105 135], der in einer zwitterionischen Form als gesamthaft elektrisch neutrale Verbindung vorliegt, der DicyanovinylFarbstoff (G) [136 137] und der asymmetrische TnmethiniumFarbstoff (H) [129 138] Die vollständigen Namen der Verbindungen sind in Kapitel 96aufgeführt Verantwortlich für die langwelligen Absorptionsbanden der Farbstoffe F und G sind die in Abbildung 75 präsentierten besonders effizienten Donorund Akzeptorsysteme Wie erwartet, traten aufgrund der elektrischen Neutralität keine schwer¬ wiegenden Loshchkeitsprobleme in apolaren Membranmedien auf Dennoch muss beachtet werden, dass es sich bei den untersuchten Verbin¬ dungen nicht um lipophihsierte Substanzen handelte, die gezielt für den Einsatz in lipophiler Umgebung optimiert wurden Aus diesem Grund zeigte der TnmethiniumIndikator (H) sowohl in DOS wie auch in o NPOEweichgemachten Membranen eine begrenzte Loslichkeit, die die Anwendung von Ultraschall zur Homogenisierung der Membranlosung erforderlich machte In Tabelle 74sind die optischen Parameter der drei Indikatoren in Losung und in weichgemachten PVCMembranen zusam¬ mengefasst 76Merocyanine als Chromoionophore 141 Abb 711 Untersuchte Merocyanin Farbstoffe F SquannFarbstoff, G DicyanovinylFarbstoff, H Trimethinium Farbstoff Der hohe molare dekadische Extinktionskoeffizient edes SquannFarb stoffes im Vergleich zu den beiden anderen Merocyaninen lasst sich damit begründen, dass die Struktur derjenigen eines symmetrischen, kationischen CyaninFarbstoffes sehr nahe verwandt ist Symmetrische CyaninFarbstoffe zeigen allgemein die höchsten Extinktionskoeffizienten innerhalb der Gruppe der Polymethin Farbstoffe 142 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIRFARBSTOFFEN Tabelle 74: Optische Eigenschaften (Wellenlänge maximaler Absorption Amax, molarer dekadischer Extinktionskoeffizient emax) von Merocyanin Farbstoffen in verschiedener Umgebung1 Farbstoff Squarin Dicyanovinyl Trimethinium (F) (G) (H) A,max Lösung 815a 763b [nm] Membran DOS 819 755 Weichmacher oNPOE 821 768 Propylen 821 768 carbonat emax Lösung 136700a 28900" [L mol"' cnT1] aLösungsmittel: Ethanol bLösungsmittel: Methylenchlorid (ungenügend löslich in Ethanol) 839a 850 n g 848 57100a 1Die Angaben beziehen sich auf die intensivste Absorptionsbandeunabhängig davon, inwelchem Protonierungszustand der Indikator vorliegt 76Merocyanine als Chromoionophore 143 762pHempfindliche Optoden basierend auf weichgemachten PVC Membranen Ein Vorteil des weichgemachten PVCSystems ist die Tatsache, dass die Polarität der Membranphase zum grossten Ted durch den ver¬ wendeten Weichmacher, der als Membranlosungsmittel dient, bestimmt wird Aus diesem Grund ist es möglich, die Losungsmittelumgebung der Membranbestandtede zu variieren, ohne aber die PolymerMatrix (PVC) wechseln zu müssen Diese Tatsache wurde ausgenutzt, um die Selektivität von lonenselektiven Elektroden [130] und die Lebensdauer von Mem¬ branen allgemein zu verlangern Im Spezialfall der optischen Sensoren können die optischen Eigenschaften sowie die scheinbaren Aciditats konstanten der Chromoionophore in der Membranphase durch Wechsel des Weichmachers modifiziert werden [139] Im weiteren beeinflusst die Loslichkeit des Farbstoffes im Weichmacher zusammen mit seiner Lipo philie die Lebensdauer der Sensormembran [81] Für diese Untersuchungen wurden lediglich drei Beispiele aus der grossen Anzahl von Weichmachern [130] evaluiert Die Auswahl wurde so getroffen, dass ein möglichst breiter Polantatsbereich, ausgedruckt durch die Dielektrizitätskonstante e, abgedeckt werden konnte Die optischen Eigenschaften der MerocyamnFarbstoffe F, G und H in PVC Membranen mit den drei ausgewählten Weichmachern sind aus Tabelle 74zu entnehmen Für den SquannFarbstoff (F) und den Tnmethimum Chromophor (H) wird kein solvatochromer Effekt beobachtet Der DicyanovinylIndikator (G) hingegen, zeigt eine bathochrome Ver¬ schiebung von 13 nm beim Wechsel von DOS zum polareren Weichmacher oNPOE oder Propylencarbonat Diese sogenannte positive Solvatochromie lasst auf eine Erhöhung des Dipolmoments im angeregten Zustand des Farbstoffs gegenüber dem Grundzustand schliessen, die zu einer Absenkung des Energieniveaus des angeregten Zustands fuhrt [140] Beim Squann und beim TnmethiniumFarbstoff tritt demzufolge keine 144 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIRFARBSTOFFEN wesentliche Änderung des Dipolmoments bei der elektronischen Anregung aufDieser Sachverhalt konnte durch PPPRechnungen bestätigt werden Abbildung 712 zeigt ein typisches Beispiel von Absorptionsspektren in Abhängigkeit des pHWertes der Probelosung für eine Optode im NIR Bereich Dieser Sensor wurde mit dem SquannFarbstoff (F) in einer DOSweichgemachten PVCMembran realisiert Die Membran enthielt zusatzlich das hpohile Boratsalz KTFPB (vgl Abschnitt 96) zur Auf¬ rechterhaltung der Elektroneutrahtat der Membranphase In Abbildung 713 ist das Resultat des analogen Experimentes mit dem Dicyanovinyl Farbstoff (G) dargestellt Die entsprechenden Spektren in PVC Membranen mit dem Weichmacher oNPOE unterscheiden sich nicht wesentlich von den in Abbildungen 712 und 713 dargestellten Resultaten Für die Ermittlung der scheinbaren Aciditatskonstante pKa der Indikatoren in den Optodenmembranen wurden die Signale im Absorptionsmaximum ausgewertet Das Spektrum des Chromoionophors F zeigt im Gegensatz zum DicyanovinylFarbstoff (G) und dem im Kapitel 754 gezeigten Indikator PDC* (D) in Bezug auf die Protolyse ein unterschiedliches Verhalten, das aufgrund der Struktur des Farbstoffs erklart werden kann Im Falle des StreptocyaninFarbstoffes PDC+ fuhrt eine vollständige Protonierung (PDCH+) zum Verlust der NIR Absorption und es tritt eine neuen Bande um 300 nm hypsochrom verschoben auf (Abb 78) Beim DicyanovinylChromoionophor stellt man gar eine Verschiebung der Bande in den UVSpektralbereich fest Fürden SquannFarbstoff hingegen, ist die beobachtete hypsochrome Wellenlangenanderung wesentlich geringer Im PDC+Ion wird das konjugierte rcSystem durch eine Protonierung (PDCH2+) vollständig unterbrochen Bei Squann muss von einer Protonierung der vinylogen Carbonsaure im Quadratsaurekern des Moleküls ausgegangen werden Dadurch wird das Resonanzsystem jedoch nicht unterbrochen, sondern durch einen veränderten externen Substituenten von aussen beeinflusst 76Merocyanine als Chromoionophore 145 Die Protonierung reduziert in diesem Fall den Elektronenuberschuss am Substituenten und kann daher formal als Einfuhrung eines Akzeptors betrachtet werden, was in dieser Position zu einer hypsochromen Verschiebung der Absorptionsbande fuhren muss (siehe Abb 73) Das Ausmass ist aber erwartungsgemass geringer, als bei einem vollständigen Unterbruch des konjugierten JtSystems Die beobachtete hypsochrome Verschiebung betragt in diesem Beispiel noch 110 nm und eine neue Absorptionsbande tritt bei 700 nm Wellenlange auf Abb 712 pHabhangige Absorptionsspektren einer Optode der Zusam¬ mensetzung M8 mit SquannFarbstoff (F) als Chromoionophor in einer DOSweichgemachten PVCMembran 146 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIRFARBSTOFFEN Der zugrundeliegende Ionenaustauschprozess folgt den Gleichungen 55 und 56 und kann schematisch folgendermassen dargestellt werden: C(mem) +1+ (mem) +R" (mem) +H+ (aq) ^ CH +(mem) +R"(mem) +r(aq) (73) Der Zusatz des lipophilen anionischen Additivs R~ ist zur Gewährung der Elektroneutralität der Membranphase notwendig Die Ansprechfunktion des Sensors lässt sich durch Gleichung 56 beschreiben und ist in Abbildung 715 dargestellt 040~| DicyanovinylFarbstoff (G) KTFPB _—PH 50 400 500600700 800 900 Wellenlänge /nm Abb 713: pHabhängige Absorptionsspektren einer Optode der Zusam¬ mensetzung M9 mit DicyanovinylFarbstoff (G) als Chromoionophor in einer DOSweichgemachten PVCMembran 76Merocyanine als Chromoionophore 147 Der zugrundeliegende lonenaustauschprozess kann in Analogie zum SquannFarbstoff (vgl Abb 712) beschrieben werden Die theoretische Ansprechfunktion, ermittelt nach Gleichung 56 ist in Abbildung 715 dargestellt Die Untersuchung der Reversibilität und des Ansprechverhaltens für den Chromoionophor F in DOSweichgemachten PVCMembranen zeigte, dass mit dem SquannFarbstoff reproduzierbare Absorptionsanderungen und stabile optische Signale erhalten werden (Abbildung 714) Arbeitete man allerdings in stark alkalischer oder stark saurer Probelosung (0 01 mol L 'NaOH resp 001 mol L 'HCl) traten Signalverluste auf, die als Hydrolyse des Indikators interpretiert wurden pH 32^pH 37 SquannFarbstoff (F) KTFPB DOS/PVC 1 10 I 20 I I 30 40 Zeit /min i 50 1 60 i 70 Abb 714 Ansprechverhalten eines pHSensors der Zusammensetzung M8 mit Squann (F) als Chromoionophor gegenüber CitratPuffer losungen bei kontinuierlichem Probenwechsel in einem Durchflusssystem 148 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIRFARBSTOFFEN Mit dem DicyanovinylFarbstoff (G) in der Membran wurde ebenfalls hohe Signalstabilitat und Reproduzierbarkeit beobachtet, solange der Sensor nicht im alkalischen Milieu eingesetzt wurde In diesem Fall verlor die NIRAbsorptionsbande irreversibel an Intensität, wahrend im sicht¬ baren Bereich (bei 600 nm) eine neue Bande zu beobachten war Besonders rasch verlief dieser Vorgang in der Gegenwart lipophder Kationen wie MTDDAC1 (vgl Kapitel 96) in der Membranphase Der Amonentauscher wirkt unter diesen Bedingungen als Phasentransfer katalysator, der HydroxidIonen in die Membran zu extrahieren vermag und somit eine basenkatalysierte Hydrolyse unterstutzt Der Gebrauch von Propylencarbonat als polarer Weichmacher führte zu Stabilitatsproblemen in der Membranzusammensetzung Der Weich¬ macher schwitzte rasch aus der PVCMembran aus, und die Polymer¬ schicht verlor ihre Flexibilität und Transparenz Es musste zusatzlich angenommen werden, dass der Weichmacher bei Kontakt des Sensors mit wassriger Probelosung aus der Membranphase ausgewaschen wird Reproduzierbare Messungen konnten mit diesem Material nicht vorgenommen werden Beruhend auf den bekannten Modellen von Bakker [32] konnten nach Gleichung 56 die Aciditatskonstanten der Chromoionophore in der Membranphase abgeschätzt werden Die pHunabhängige Auftragung der Ansprechkurven für die verschiedenen Sensormembranen findet man in Abbildung 715 Die zugehörigen Daten der experimentell ermittelten pKaWerte in der Sensormembran sind in Tabelle 75 wiedergegeben Daraus kann entnommen werden, dass der Weichmacher oNPOE mit einer höheren Polarität (höhere Dielektrizitätskonstante e) als DOS zu einer verstärkten Basizitat der Indikatoren fuhrt Diese erwartete Beobachtung lasst sich durch die höhere Stabilisierung der protonierten, elektrisch geladenen Moleküle über DipolDipol Wechselwirkungen in der polareren Umgebung erklaren Das Ausmass der Stabilisierung hangt im einzelnen aber von den Eigenschaften des Indikators ab Für den Squann 76Merocyanine als Chromoionophore 149 Indikator wurde ein kleineres Inkrement des pKaWertes beobachtet (ApKa = 17), wahrend im Falle des DicyanovinylFarbstoffes eine Basizitatserhohung von 25 pKaEinheiten festgestellt wurde Es kann davon ausgegangen werden, dass die SquannVerbindung in der Membran in zwitterionischer Form auftritt Eine Erhöhung der Polantat der Umgebung fuhrt zu einem geringeren, zusätzlichen Stabihtatsgewinn im Vergleich zum DicyanovinylFarbstoff, da der SquannChromoionophor bereits in der nicht protonierten neutralen Form elektrische Ladungen tragt, im Gegensatz zur ungeladen vorliegendenDicyanovinyl Verbindung Tabelle 75 Aciditatskonstanten pKa für Merocyanine in PVCSensor membranen mit unterschiedlichen Weichmachern Die Dielektrizitäts¬ konstante ediente der Quantifizierung der Polarität des Weichmachers rarnsion Weichmacher DOS oNPOE Propylen carbonat £[130 141] 39±0 1 23 9±0 3 70 5±5 0 (Membran)(Membran) (Membran) Squann (F) pKa 27±0 1 44±0 1 a (M8) (MIO) (M12) Dicyanovinyl (G) pKa 40±0 1 65±0 1 a (M9) (Mll)(M13) Tnmethinium (H) pKa 11 5±0 0 ng ng (M14) a Die ungenügende Membranstabihtat (siehe Text) erlaubte keine Bestimmung 150 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIRFARBSTOFFEN 1On 08H T3 c /aH*] i 12 Abb 715 Ansprechkurven für Farbstoffe F (•, log Klxlh=2 4, M8), G (A, log Ktxü=3 7 M9) und H (, log KtxJ=l 13, M14) in DOSweich¬ gemachten PVCMembranen sowie F(O, log KtxUl=2 6, MIO) und G (A, log KlXL,,=4 7, Mll) in Membranen mit ^NPOE Dieausgezogenen Linien stellen die angepasste theoretische Ansprechfunktion, ermittelt nach Gleichung 514 dai Nachdem nun mit drei verschiedenen Vertretern aus der Gruppe der Merocyanine erfolgreiche Messungen in weichgemachten PVC Membranen durchgeführt worden waren, stellte sich die wichtige Frage, ob sich die untersuchten Verbindungen als Chromoionophore in Kombination mit einem lonenselektiven Liganden zu einem optischen Sensor für Kationen oder Anionen kombinieren lassen Im Kontrast zu den kationischen Cyanin und StreptocyamnFarbstoffen war in diesem Fall nicht die Loslichkeit der Komponenten in lipophder Umgebung das ausschlaggebende Kriterium Für die Verbindungen F und G bestand 76Merocyanine als Chromoionophore 151 zudem eine relativ einfache Möglichkeit zur Lipophdisierung durch Einführung langkettiger Alkylreste wahrend der Synthese Wichtiger war in diesem Zusammenhang die Frage nach der Basizitat des Chromo lonophors im Verhältnis zur Komplexstabditatskonstante die zusammen mit dem pH Wert der Probelosung den Ansprechbereich desSensors bestimmt (vgl Kapitel 73) Der Vergleich dei Daten aus Tabelle 75mit Abbildung 72zeigt dass einzig dei Trimethimum Chromoionophor (H) eine Basizitat autweist die für eine Kombination mit den ttaditionellen kuttonenselekmen ETH Liganden [142| genügend hoch ist Ionensclekme Messungen im physiologischen pHBeieich mit dem Indikator F als Chromoionophor sind ausgeschlossen Auch wenn sieh dei pK, Weit des Dic\ano\m\l Indikatois (G) durch die Wahl eines polaieren Weichmachers zu basischeren Weiten \etschieben lasst ieicht diese VeisiJuebung nicht aus um einen kationenselektiven Sensot tut Analysen im philologischen pH Bereich in dei unverdünnten Piobe mit einem bekannten lonophoi zu realisieren Anwendungen iintei Bedingungen bei welchen im staik sauren pH Bei eich in vei dünnten Losungen odei in Kombination mit einem Liganden mit veihaltnismassig kleiner Komplexierungskonstante geuibeitet wird, sind jedoch denkbar 763Ca +selektive Optode tur den binsatz im NIR Spektrulbereieh Der Trimethimum Farbstott (H) wurde erfolgreich in DOS weich gemachten PVC Membranen als Chromoionophor tur Ca +Messungen in Kombination mit dem Liganden FTH 1001 eingesetzt Die Abbildung 716 zeigt die Absorptionsspektren des optischen Sensors mit dem lonophoi ETH 1001 und dem Chromoionophor Trimethimum (H) in Kontakt mit Ca2+Losungen 152 OPTISCHE SENSOREN AUFDER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN 300 400 500 600 700 800 900 Wellenlange /nm Abb 716 Absorptionsspektren einer Ca1+selektiven Optode der Zusam¬ mensetzung Ml5, die mit verschiedenen Ca,+haltigen, bei pH 48 ge¬ pufferten Losungen äquilibriert wurde Der zugrundeliegende lonenaustauschvorgang wird durch Abbildung 52a sowie durch Gleichung 57repräsentiert Die fünf deutlichen isosbestischen Punkte belegen, dass wahrend diesem Experiment kein Verlust an Chromoionophor auftrat In Abbildung 717 ist die zugehörige, nach Gleichung 514 berechnete Kalibrationskurve dargestellt 05 04 co | 03 xLU 02 0 1 76Merocyanine als Chromoionophore 153 10| 08 73roD) g,06c^_0 o 04 o Q 02 00 l Tnmethinium (H) ETH 1001 NaTFPB DOS/PVC Natnumacetatpuffer pH 48 4 log aCa2 r 0 Abb 717 Kalibrationskurve für eine Ca+selektive Optode der Zusam¬ mensetzung M15 in Kontakt mit verschiedenen Ca+haltigen, bei pH 48 gepufferten Losungen Dieausgezogene Kurve wurde nach Gleichung 514 mit log K^ =5 3berechnet Das Ansprechverhalten bei vollständiger Protonierung und Deproto¬ nierung war reversibel und führte zu stabilen, reproduzierbaren optischen Signalen, wie sie in Abbildung 718 dargestellt sind In gepufferten, Ca2+ haltigen Probelosungen wurden gegenüber metalhonenfreien Losungen (Abb 718) deutlich längere Ansprechzeiten beobachtet, wie der Wechsel zwischen 10 'und 10~4 mol L 'Ca2+Losung in Abbildung 719 zeigt Dieses Verhalten kann mit den unterschiedlichen Diffusionskoeffizienten für Protonen und für Ca2+Ionen sowie mit der verschiedenen Austauschkinetik von Ionen am lonophor und Protonen am Chromo¬ ionophor erklart werden und wird für alle IonenaustauschOptoden 154 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN beobachtet [80] Man geht davon aus, dass die Diffusion der verschiedenen Spezies in der Membranphase limitierend ist und die Geschwindigkeit bestimmt 0806 0807 0805 0802 08 W =45 S W =45 s »95% =45 S 07 ?c 001 mol L"1 HCl (850 oCD1 Extinktion o o * Ol i i , 001 mo L1KC )HI 03 W =96 SJ W =81 s I t95% =78 s ^v 02 0250 0248 0250 I I I I II 0 5 10 15 20 25 3( Zeit/ min Abb 718 Kurzzeitreproduzierbarkeit einer Optode der Zusammen¬ setzung M15 mit Chromoionophor Trimethimum (H) gegenüber voll standiger Protonierung und Deprotonierung bei kontinuierlichem Probe Wechsel Messlosungen 001 mol L 'HCl und 001 mol L 'KOH Die angegebenen Extinktionswerte wurden unmittelbar vor dem Proben¬ wechsel gemessen Bei den hier angegebenen Ansprechzeiten t,,^ ist es wichtig zu beachten, dass diese für einen kontinuierlichen Probenwechsel gültig sind Bei Anwendung eines BatchVerfahrens mit vollständiger Entleerung der Messzelle zwischen einzelnen Messungen werden wesentlich kürzere An 76Merocyanine als Chromoionophore 155 Sprechzeiten beobachtet, da keine Mischeffekte in derMesszelle oder innerhalb des Probenflusses (carry over) eintreten So reduzierte sich unter diesen Bedingungen die Ansprechzeit für einen Konzentrations¬ sprung von 10 4zu 10 'mol L'Ca,+Losung in Acetatpuffer von rund 2 min auf lediglich 12 sund tur die Konzentrationsabnahme von 10 'auf 10 4mol L 'Ca1+ Losung von 45 min auf 20 s Das wiederholte vollständige Entleeren und sehr rasche Füllen der relativ grossen Mess zelle führte aber zu weniger reproduzierbaren optischenSignalen und teilweise zu mechanischer Beschädigung der Sensormembran O100 0101 0101 n r\ r\ W =281 S, »95% =275 S 104 mol L1CaCL, inPuffer 0101 S 0095 CO, co |= 0090 ,2 t95% =128s t95%=112s| tQW„=125s 0085 u 0101 r 0086 0086 0086 10 3mol L1CaCI2 inPuffer —i 1 r~ 10 20 30 Zeit /min Abb 719 Kurzzeitreproduzierbarkeit einer Optode der Zusammen setzung M15 mit Chromoionophor Trimethimum (H) und lonophor ETH 1001 bei kontinuierlichem Losungswechsel Die angegebenen Extinktions werte wurden unmittelbar vor dem Probenwechsel gemessen 156 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIRFARBSTOFFEN Die Lebensdauer des Sensors wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht in ausführlichen Langzeitstudien untersucht Es zeigte sich aber, dass die Membranen auchnach zweiwöchiger Lagerung in Acetatpuffer unter Ausschluss von Licht einsatzfahig blieben Beider Spulung des Sensors mit destilliertem Wasser (1 5mL /min) wahrend 15 Stunden, wurde bei einer Wellenlange von 850 nm ein Signalverlust von 5% festgestellt Um die Lebensdauer von Optoden zu erhohen, wurde abgeklärt, wieweit die Viskosität einer PVCFlussigmembran erhöht werden kann, ohne damit die Ansprechzeiten drastisch zu verandern [80 143] Dadurch konnte das Auswaschen von Membrankomponenten bei gleichzeitigem, mecha¬ nischem Stabditatsgewinn vermindert werden Reduzierte man das Ver¬ hältnis von Weichmacher zu PVC m einer Optodenmembran von 21auf 11, wurde die Ansprechzeit um lediglich einen Faktor von 23 ver¬ längert Erst wenn man das ursprüngliche Mengenverhältnis auf 12um¬ kehrte, beobachtete man eine Reduktion der Ansprechgeschwindigkeit um mehr als einen Faktor 20 Anderen Autoren ist es gelungen, die Lebens¬ dauer durch Immobilisierung von Chromoionophoren und anionischen Ladungszentren zu erhohen [144], wobei auch dieses Vorgehen in der Regel zu einer Reduktion der Ansprechgeschwindigkeit fuhrt Mit dem TrimethiniumFarbstoff (H) als Chromoionophor wurde ein optischer Sensor realisiert, mit dem sich im NIRSpektralbereich bei 850 nm Wellenlange Bestimmungen von Kationen durchfuhren lassen In dieser Arbeit wurde eine Ca2+selektive Optode als Beispiel demonstriert Für eine Erfassung der freien Ionenkonzentration von Ca2+ in klinischen Blutproben, die das Arbeiten bei einem physiologischen pH von 74 voraussetzt, ist die Basizitat des Chromoionophors allerdings zu gering Dennoch kann man festhalten, dass der Indikator eine ausreichende Basizitat aufweist, um NIRaktive Optoden mit weiteren selektiven Liganden für Kationen, wie sie in der Literatur beschrieben sind, zu realisieren Diese Annahme lasst sich damit begründen, dass der 76Merocyanine als Chromoionophore 157 TrimethimumFarbstoft in der Membran einen pKaWert aufweist, der demjenigen der bis anhin eingesetzten Chromoionophore vom Nilblau Typ sehr ähnlich ist 764 Schlussfolgerungen Drei Farbstoffe aus der Untergruppe der elektrisch neutralen Merocyanine wurden im Hinblick auf ihre Eignung als NIR aktive Chromoionophore für Optodenmembranen untersucht Die Tri¬ methimumVerbindung vermochteden meisten der in Kapitel 73zusam¬ mengetragenen Anforderungen zu genügen und hess sich zusammen mit einem Liganden für Ca+selektive Messungen im NIRBereich einsetzen Die Squarin und die DicyanovinylVerbindungen konnten die Be¬ dingungen an die Basizitat nicht erfüllen und hessen sich daher nicht mit einem Ionophoren zu einer lonenselektiven Optode für physiologische Probenkombinieren Der Einsatz als NIR pHIndikator ist zwar möglich, vor allem aber beim SquannDerivat wegen des tiefen pKaWertes kaum von praktischem Interesse Ein Versuch der Modifikation der Molekul struktur zur Erhöhung der Basizitat und der Lipophdie stand nicht zur Diskussion Dies vor allem deshalb, weil die bestehenden Grundstrukturen gegenüber alkalischer Probelosung nur ungenügende Stabilität aufwiesen Obwohl nicht alle Voraussetzungen erfüllt waren, wurde eine Optode mit dem DicyanovinylChromoionophor als Versuchsmembran für Messungen auf einem integrierten optischen Chip eingesetzt, da die Wellenlange der Lichtabsorption sich ideal mit der Emissionswellenlange der zur Verfugung stehenden Lichtquelle deckte und die Sensormembran zu sehr reproduzierbaren Signalen führte (vgl Kapitel 78) 158 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIRFARBSTOFFEN 77 Reduzierte DicyanovinylFarbstoffe 771Ausgangslage Im Zusammenhang mit der Synthese des DicyanovinylFarbstoffs (G) wurde als Nebenprodukt ein weiteres Farbstoffmolekul mitisoliert, das wegen seiner pHabhangigen Farbeigenschaften eingehend untersucht wurde Alle bis anhin diskutierten Beispiele von NIRChromoionophoren, inklusive dem DicyanovinylIndikator, gehorten formal der Klasse der Polymethin Farbstoffe an Die neu isolierte Verbindung hess sich aber nicht einer der bisher bekannten Farbstoffklassen zuordnen Es handelte sich um einen elektrisch neutralen, vom DicyanovinylIndikator (G) abge¬ leiteten, reduzierten Farbstoff Formal betrachtet erfolgte eine Addition von H2 an die CNDoppelbindung des Eduktes Es wird vermutet, dass Bespalov et al bereits im Jahre 1991 im Rahmen der Synthese des DicyanovinylIndikators auf Farbstoffe von diesem Typ gestossen sind, sie aber nicht als solche erkannt haben [137] Die Autoren beobachteten in den Massenspektren dervermeintlichen DicyanovinylVerbindungen Signale für das Molekuhon, die um zwei Masseneinheiten zu hoch ausfielen, ohne eine Erklärung dafür zu finden Dabei handelte es sich möglicherweise um die reduzierte Form des DicyanovinylFarbstoffes, die sich um zwei Masseneinheiten vom Vorlaufer unterscheidet Abbildung 720 gibt die Strukturen der Reihe von reduzierten Dicyano vtnylFarbstoffen wieder Zum Thema der Synthese, Strukturaufklarung und bestatigung sei an dieser Stelle auf die Arbeit von Jenny et al ver¬ wiesen [145] Ausgehend von der Grundstruktur, dem sekundären Amin ETHT 5003 (R=H), hessen sich die Farbstoffe ETHT 5004, 5005, 5006, 5007, 5008 und 5009 relativ einfach synthetisieren Dadurch erhielt man die Möglichkeit, wichtige Charakteristika wie optische Eigenschaften und Basizitat der Chromoionophore mit einfachen synthetischen Mitteln durch 77 Reduzierte Dtcyanovinyl Farbstoffe 159 Änderung des Substituenten R am sekundären AminStickstoff zwischen den beiden Ringsystemen zu variieren Farbstoff ETHT 5003 ETHT 5004 ETHT 5006 ETHT 5007 ETHT 5008 Abb 720 Konstitutionsformeln der Chromoionophore ETHT 5003, 5004, 5005, 5006, 5007, 5008 und 5009 1Postulierte Struktur (konnte wahrend dieser Arbeit nicht definitiv bestätigt werden) R H \ / P(C6H5)3 O O 160 OPTISCHE SENSOREN AUFDER BASIS VON NIRFARBSTOFFEN Farbstoff ETHT 5009 R ETHT 5005 Abb 720 (Fortsetzung): Konstitutionsformeln der Chromoionophore ETHT 5003, 5004, 5005, 5006, 5007, 5008 und 5009 Im elektrisch neutralen, dh im protonierten Zustand wurde für diesen Verbindungstyp keine Absorptionsbande im NIRBereich beobachtet, während im anionischen, deprotonierten Zustand breite Banden auftraten, die sich bis in denNIRBereich hinein erstreckten Im Vergleich zu den Cyanin und StreptocyaninFarbstoffen wiesen die Absorptionsbanden wesentlich geringere Extinktionskoeffizienten auf Es wurde postuliert, dass das Proton am Kohlenstoff (C2) innerhalb des 5gliedrigen Rings des Indansystems, benachbart zum AminStickstoff, bei der De¬ protonierung abgegeben wird Diese Vermutung wurde im Verlauf der Arbeit durch mehrere Indizien unterstützt (vgl Tab 76 und Abb 721 Spektrum von ETHT 5005) Bei den reduzierten Dicyanovinyl 77Reduzierte DicyanovtnylFarbstoffe 161 Verbindungen handelt es sich demzufolge um sogenannte CSauren In Tabelle 76sind die optischen Eigenschaften derIndikatoren in metha¬ nolischer Losung zusammengestellt Die zugehörigen Absorptionsspektren finden sich in Abbildung 721 lETH 5003 00 i r 400 600 800 Wellenlange /nm 05 04 03 02 01 H 00 ETH 5004 1 1 400 600 800 Wellenlange/ nm 03 I 02 xtu 01 oo ETH 5005 i 1 r^ 400 600 800 Wellenlange /nm "lETHT 5006 006 r\ 004 \/ \ 002 \l \ nnn \ i i r 400 600 800 Wellenlange /nm Abb 721: UV /VISSpektren der Chromoionophore in Methanol (varia¬ ble Konzentrationen) Ausgezogene Kurven: deprotonierte, anionische Form; durchbrochene Kurven: protonierte Form; ETHT 5005 ist nicht deprotomerbar 162 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIRFARBSTOFFEN ETH 5007 1 T 400 600 800 Wellenlänge /nm coVcX111 08t 06 04 02 00Jr ETH 5009 T" 400600800 Wellenlänge/ nm 06 05 04 03 021 01 00 1 n~ 400 600 800 Wellenlänge /nm Abb 721 (Fortsetzung): UV /VISSpektren der Chromoionophore in Methanol (variable Konzentrationen) Ausgezogene Kurven: depro¬ tonierte, anionische Form; durchbrochene Kurven: protonierte Form werden bestimmt nicht koeffizienten Extinktions¬ dekadischen molaren die konnten bestätigen, zu Verbindung der Struktur die war, gelungen nicht es Daa 9000 637 7000 7000 bestimmt" nicht deprotomerbar nicht deprotonierbar nicht 594 3000 576 3000 752 bestimmt" nicht 12000 12000 759 717 3000 8000 8000 8000 cm"']' mol [Le [nm] A,max '] cm' mol [Le Form Unprotomerte Form Protonierte 500 5009 ETHT 525 5008 ETHT 513 5007 ETHT 604 5006 ETHT 609 5005 ETHT 597 5004 ETHT 588 5003 ETHT ^max Chromoionophor Losung scher methanoh in 5009 5003 ETHT Chromoionophore der emax) koeffizient Extinktions¬ dekadischer molarer Amax, Absorption maximaler (Wellenlange Eigenschaften Optische 67 Tabelle 164 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN Wie zuvor erwähnt, lassen sichdie neutralen Chromoionophore vom Typ ETHT 5003 5009 zunächst keiner bis anhin bekannten Klasse von Farbstoffen zuordnen Betrachtet man aber den deprotonierten, an ionischen Zustand des Indikators, kann eine analoge Struktur wie für die von Figala et al beschriebenen, im langwelligen Spektralbereich absor bierenden Ybde des Cyclopentadiens postuliert werden [146] Dies bedeutet, dass die Absorptionseigenschaften hauptsächlich durch das an ionische Indansystem bestimmt werden Für das Ringsystem lasst sich im anionischen Zustand ein NZentren (N=9) und N+l 7tElektronensystem postulieren (siehe Abb 722), wobei das freie Elektronenpaar in Position 2die Rolle des Donors übernimmt Eine 7tResonanzwechselwirkung über das Indansystem hinaus erscheint fürdie Erklärung des beobachteten optischen Verhaltens der Verbindungen nicht zwingend [146] Inter¬ aktionen mit Substituenten R in Position 2über oOrbitale müssen jedoch angenommen werden Abb 722 Primares Chromo phorsystem für die Verbindungen ETHT 5003 5009 im deproto¬ nierten, anionischen Zustand NC Die Akzeptor oder Donoreigenschaften des Substituenten R (Abb 720) üben einen starken Einfluss auf die Lage der langwelligen Absorptions¬ bande aus So wird im Falle von elektronenziehenden Substituenten R (ETHT 5007, 5008 und 5009) eine gegenüber den Chromoionophoren ETHT 5003, 5004 und 5006 hypsochrome Verschiebung des Absorptionssignals für den deprotonierten, anionischen Zustand beobachtet 77 Reduzierte DtcyanovinylFarbstoffe 165 7 7 2pHempfindliche Optoden basierend auf weichgemachten PVC Membranen Bei Experimenten mit dem Chromoionophor ETHT 5003 in alkoho¬ lischen Losungen wurde festgestellt, dass der Indikator eine sehr hohe Basizitat aufweist und sich nur unter extremen Bedingungen (konz NaOH in Methanol) deprotomeren und damit in eine NIRaktive Form über¬ fuhren lasst Nach Zufügen des lipophilen Tetrabutylammonium hydroxids, wurde eine Deprotonierung schon nach Zugabe geringerer Menge an Base erreicht In PVCMembranen, die nur den Chromoionophor ETHT 5003 enthielten, konnte selbst in stark alkalischen Proben (pH 14) keine Deprotonierung in Folge eines Ionenaustausches mit Kationen aus der Probelosung beobachtet werden Der Ersatz des Weichmachers DOS durch das polarere «NPOE vermochte diese Tatsache nicht zu verandern Fugte man hingegen hpophile kationische Zentren in Form des Anionen tauschersalzes MTDDAC1 dem Membrancocktail hinzu (100 mol% in Bezug zum Chromoionophor), konnte der Chromoionophor reversibel deprotoniert und protomert werden Dabei trat im anionischen Zustand ein breiter Absorptionspeak mit einem Absorptionsmaximum bei 734 nm auf, dessen langwellige Schulter bis zu Wellenlangen oberhalb von 800 nm reichte Weitere Experimente bestätigten die Vermutung, dass sich der Chromoionophor ETHT 5003 nui in der Gegenwart von frei vorliegenden, lipophilen Kationen (R+) in der Membranphase de¬ protomeren lasst Offensichtlich ist das hpophile Kation als Gegenion für die Stabilisierung des resultierenden Anions des Chromoionophors (C )in der Membranphase notwendig In Abbildung 723 findet man die Spektren, wie sie mit einem Sensor mit ETHT 5003 als Chromoionophor gegenüber Pufferlosungen mit variablem pH gemessen wurden 166 OPTISCHE SENSOREN AUFDER BASIS VON NIRFARBSTOFFEN 035 030 ETHT 5003 MTDDACI DOS /PVC *^ pH 140 /^"pH 130 /^S^"pH 120 """^""pH 115 ^y^^pH 110 025 y^y^ZpH 105 q V" pH 100 I 020 XLU ^^m^PH 95 ^\___pH 89 015 3^5^Tph 80 ><^l8f^pH 75 010 X^^L^PH 70 ^^^^SpH 66 ^g^J^pH 61 500 600 700 800 Wellenlänge /nm Abb 723: Titration von ETHT 5003 mit Universalpuffer (pH 60 120; H,BO, /KH2P04 /KCl /KOH) und KOH (pH 130 140) in einer Sensor¬ membran der Zusammensetzung Ml6 Aufgrund des hohen Anteils (100 mol%) von lipophilen Kationen R+ wird von einer Koextraktion von Protonen und Anionen aus der Membran¬ phase ausgegangen Das zugrundeliegende Koextraktionsgleichgewicht lässt sich wie folgt formulieren: CH(mem) +R+X"(mem) "» C"(mem) +R+(mem) +H+(aq) +X"(aq) (74) 77 Reduzierte Dtcyanovinyl Farbstoffe 167 Dies äussert sich dann, dass die Eigenschaften des im Puffer vorliegenden Anions einen nicht vernachlassigbaren Einfluss auf den Protonierungsgrad des Indikators ausüben Lipophile Anionen lassen sich wesentlich leichter in die apolare Membranphase extrahieren als hydrophile Anionen und fuhren bei konstantem pH Wert der Probe zu einem höheren Proto merungsgrad des Indikators in der Membran Für die Titrationsexperi¬ mente wurde ein Universalpuffer gewählt, der einen weiten pHBereich abdeckte Dadurch konnte ein abrupter Wechsel des Puffersystems und damit des PuflerAmons bei einem bestimmten pHWert vermieden werden Zusätzlich wurde ein konstanter, relativ hoher Ionenhintergrund (0 1mol L'KCl) eingestellt 040 035 030 025 020 015 010 005 ETH 5003 /MTDDACI /DOS /PVC 0324 0324 0324 0324 0323 0323 n n 001 mol L1KOH 001 mol L HCl u U 0083 0081 0083 0084 0085 0085 T 1 1 11 1 1 0 10 2030 40 50 60 Zeit /min Abb 724 Kurzzeitreproduzierbarkeit einer Optode der Zusammen¬ setzung M16 mit Chromoionophor ETHT 5003 bei kontinuierlichem Losungswechsel Die angegebenen Extinktionswerte wurden unmittelbar vor dem Probenwechsel gemessen 168 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN Abbildung 724 zeigt dass mit dem Sensor eine sehr gute Kurzzeitrepro duzierbarkeit beim Probewechsel zwischen 001 mol L1 KOH und 001 mol L'HCl erreicht wurde Auch gegenüber konzentnerterer Base (1 mol L'KOH) wurden stabile und reproduzierbare Signale beobachtet, was im Gegensatz zu den Dicyanovinyl Farbstoffen auf eine hohe Stabilität der Verbindung im stark alkalischen Milieu und eine gute Loslichkeit in apolarer Membranumgebung schliessen lasst Auch nachdem der Sensor mehrere Tage in Universalpuffer (pH 7) gelagert worden war, konnten Signale von identischer Intensität gemessen werden Die Stabilität des Chromoionophors im betrachteten System war sehr gut Für die Ansprechzeiten dieses Membrantyps fand man im kontinuierlichen Durchflussbetrieb Werte von (133 ± 5) sfür die vollständige Depro¬ tonierung (n=6, 95%) und (90 ± 5) sfür die vollständige Protonierung (n=5, 95%) DieReduktion der Ansprechgeschwindigkeit gegenüber einer Sensormembran mit dem TnmethiniumFarbstoff (siehe Abb 718) steht in Übereinstimmung mit der Tatsache, dass die C Sauren kleinere Ge schwindigkeitskonstanten für Protomerungs und Deprotomerungs reaktionen aufweisen, als beispielsweise Moleküle, die an einem Sauer¬ stoff oder StickstoffZentrum protomert, respektive deprotoniert wer den Dies wird mit der für CSauren im Verlauf der Reaktion notwendigen Umhybridisierung am KohlenstoffAtom begründet Durch eine Alkylierung des AminStickstoffs von ETHT 5003 gelangte man zum Chromoionophor ETHT 5004 Die Absicht war es zu verifizieren, ob ETHT 5003 am CAtom in Position 2des Indansystems, in aStellung zum AminStickstoff, deprotoniert wird Mit der alkylierten Verbindung wurde in PVCSensormembranen in der Gegenwart von MTDDA+ als hpophiles Kation ein sehr ahnliches Verhalten beobachtet wie für ETHT 5003 Der einzige Unterschied bestand dann, dass der alkylierte Chromoionophor eine gegenüber dem Vorlaufer leicht erhöhte Basizitat aufwies, was sich über den induktiven Effekt des Alkyl 77Reduzierte Dicyanovinyl Farbstoffe 169 Substituenten erklaren lasst Im weiteren waren keine Unterschiede gegenüber ETHT 5003 zu vermerken Dadurch wurde das Postulat einer Deprotonierung in Position 2erhärtet Am Beispiel dieses Chromoionophors wurde der Einfluss der Konzen¬ tration an lipophilen Kationen MTDDA+ in der Membranphase auf das Ansprechverhalten untersucht Dazu wurden PVCMembranen mit 10, 50, 100, 150 und 200 mol% an MTDDAC1 im Verhältnis zum Farbstoff ETHT 5004 eingesetzt Die Resultate sind in Abbildung 725 zusammen¬ gestellt Es wurde das Verhältnis der Intensitäten zwischen den Signalen für den deprotonierten Chromoionophor C (774 nm) und den protonierten Chromoionophor CH (592 nm) gegen den pHWert der Pufferlosung aufgetragen 40, 35 30 25 ;20 M5 10 05 00 Zusatz von MTDDACI inBezug zur Kqnzen tration von ETH 10mol%m DOS X 50mol% inDOS T 100mol%in + 150mol%in200 mol% in 6 8 10 pH der Pufferlosungen 1214 Abb 725 Einfluss der Konzentration von lipophilen kationischen Zen¬ tren in PVCMembranen mit dem Chromoionophor ETHr 5004, Mem¬ branzusammensetzungen Ml 721 170 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN Aus Abbildung 725 ist ersichtlich, dass ein grosserer Anteil an lipophilen Kationen R+ in der Membran zu einem erniedrigten scheinbaren pKaWert des Chromoionophors fuhrt Wie bereits erwähnt, wird angenommen, dass 100 mol% (im Verhältnis zum Farbstoff) des Zusatzes zur Stabi¬ lisierung der resultierenden negativen Ladung des deprotonierten Indi¬ kators notwendig sind Man stellt fest, dass eine Zunahme der Kon¬ zentration von R+ über 100 mol% hinaus, die gleichzeitig einer Erhöhung der Ionenstarke in der Membranphase entspricht, zu einer steileren Stei¬ gung der Ansprechfunktion fuhrt Erst bei einer Konzentration an MTDDA+ von 200 mol% kann ein Abflachen der Kurve, das bedeutet eine vollständige Deprotonierung bei erhöhtem pHWert (pH>13) beobachtet werden Die höhere Ionenstarke in der Membranphase hat eine Abnahme des Debye Radius zur Folge Dies bedeutet wiederum, dass der ionische Zustand stabilisiert und demzufolge die Deprotonierung des Indikators erleichtert wird Für die praktische Anwendung des Chromoionophors ist es sinnvoll, den Anteil an kationischen, als Anionentauscher agierenden Zentren so gering wie möglich zu halten, um nicht einen unselektiven Ionenaustausch zu provozieren Daher wurden für alle Applikationen Optodenmembranen mit 100 mol% an MTDDAC1 eingesetzt Dadurch konnte verhindert werden, dass nach der Deprotonierung des Chromoionophors ein Uberschuss an freien Ionentauscherzentren vorliegt Die Verbindung ETHT 5005 zeigte keine pHabhangigen spektralen Ver¬ änderungen, was auf das Fehlen eines Protons in aStellung zum Amin Stickstoff zurückgeführt wurde Der Indikator diente daher als wichtiger Hinweis für die Deprotonierung am zuvor postulierten Kohlenstoff Zentrum Ferner wurden nützliche Informationen für die Struktur aufklarung der Reihe von Farbstoffen gewonnen [145] Im weiteren wurde versucht, durch Einfuhrung einer Seitenkette mit einem positiv geladenen PhosphinZentrum als Substituent am Amin 77 Reduzierte DtcyanovinylFarbstoffe 171 Stickstoff einen lipophilen kationischen Chromoionophor (ETHT 5006) zu erhalten Damit sollte erreicht werden, dass im Gegensatz zu ETHT 5003 und 5004 kein Zusatz von lipophilen kationischen Komponenten zum Chromoionophor in der Membranphase notwendig ist, um diesen zu deprotonieien, sondern eine intramolekulare Stabilisierung der resul tierenden negativen Ladung in Form eines Betains erfolgt Es gelang jedoch nicht, die Struktur der Verbindung ETHT 5006 schlussig zu ermitteln und zu bestätigen Dennoch wurde der Indikator in Optoden membranen eingesetzt Die entsprechenden Spektren mit ETHT 5006 als Chromoionophor ohne weitere Zusätze sind in Abbildung 726 wiedergegeben pH 11 5 012 ^""""^ pH 11 0 ^2__pH 10 5 011 —pH 10 0 uon ^^H|{ pH 95 c 010 »feä^5— pH 8 9 LU ^LvGLpH 85 009 >^Lph 80 yyf PH 75 008 ETHT 5006^V\\, ,w c a>coo\— 06 04 02 4 log aCaa ETH 5009 ETH 1001 DOS/PVC Ameisensaure puffer pH 27 i 0 Abb 730 Kalibrationskurve für eine Ca2+selektive Optode der Zusam mensetzung M26 in Kontakt mit verschiedenen Ca'+haltigen, bei pH 27 gepufferten Losungen Die ausgezogenen Kurve wurde nach Gleichung rCaL 515 mit log Krrh2 =19 berechnet Das experimentelle Verhalten steht in guter Übereinstimmung mit der Theorie Nur in sehr verdünnten Losungen kann eine schwache Interferenz durch K+Ionen aus der Pufferlosung beobachtet werden 180 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN 0095 0090 00851 8 0080 H CD o 0075 ~ 0 070 LU 0065 0060 ETH 5009/ETH 1001 /DOS/PVC 10~3 mol L~1 CaCI2 in Puffer 0086 0085 0084 0064 0064 104 mol L 1CaCI2 in Puffer 0 20 40 Zeit /min 60 0 064 80 Abb 731 Kurzzeitreproduzierbarkeit einer Ca'+ selektiven Optode der Zusammensetzung M26 mit Chromoionophor ETHT 5009 und lonophor ETH 1001 bei kontinuierlichem Losungswechsel (pH der Pufferlosung 27) Die angegebenen Extinktionswerte wurden unmittelbar vor dem Probenwechsel gemessen Abbildung 731 zeigt die Ansprechgeschwindigkeit und die Kurzzeitre¬ produzierbarkeit, wie sie mit der Ca2+selektiven Optode im kontinuier¬ lichen Durchflussbetneb gemessen wurde Im Vergleich zum Ca,+Sensor mit dem Trimethimum Chromoionophor stellt man eine deutliche Reduk¬ tion der Ansprechgeschwindigkeit fest Diese lasst sich wiederum mit der langsameren ProtonierungsKinetik von CSauren (ETHT 5009) im Vergleich zu einer Verbindung, die am StickstoffZentrum protoniert oder deprotoniert wird (TnmethiniumIndikator) begründen 77Reduzieite DtcyanovinylFarbstoffe 181 774 Schlussfolgerungen Mit dem Chromoionophor ETHT 5003 und den substituierten Derivaten ETHT 5004 5009 wurde eine Spezies von Farbstoftmolekulen gefunden, die sich vom Aufbau des Chromophors her nicht den bisher bekannten Gruppen zuordnen lasst und eine neue Klasse von Farbstoffen repräsentiert Obwohl es im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich war, das spektroskopische Verhalten der Verbindungen vollständig zu erklaren, wurden die Farbstoffe aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften als Chromoionophore in Optodenmembranen eingesetzt und charakterisiert Die Indikatoren zeichnen sich durch eine äusserst hohe Stabilität sowohl gegenüber saurer, wie auch gegenüber basischer Losung aus Eine Deprotonierung am KohlenstoffZentrum C2 des Indansystems fuhrt zu einer breiten, langwelligen Absorptionsbande, die in Abhängigkeit des Substituenten am AminStickstoff bis in den NIRSpektralbereich reicht Die Aciditat der Chromoionophore wird zu einem hohen Ausmass durch die chemische Umgebung des Farbstoffes bestimmt In weichgemachten PVCMembranen lassen sichdie Indikatoren ETHT 5003 und 5004 nur in der Gegenwart des lipophilen kationischen Salzes MTDDACl depro tomeren Der Chromoionophor ETHT 5006 vermag die resultierende negative Ladung der korrespondierenden Base als Betain intramolekular zu stabilisieren Eine Substitution am AminStickstoff mit elektronen¬ ziehenden Substituenten fuhrt zu einer gesteigerten Aciditat der Chromo¬ ionophore (ETHT 5007, 5008 und 5009) Gleichzeitig wird aber eine starke hypsochrome Verschiebung der Absorptionsbande der deproto¬ nierten Spezies beobachtet Ein bis anhin nicht erwähnter Vorzug der Chromoionophore vom Typ ETHT 5003 hegt in der chemischen Funktionalitat der Verbindung Wie fürdie Synthese derDerivate ETHT 5004 5009 angewendet, lasst sich die sekundäre Aminogruppe der Grundstruktur ETHT 5003 für kovalente 182 OPTISCHE SENSOREN AUFDER BASIS VON NIRFARBSTOFFEN Bindungen nutzen, ohne dass die Grundstruktur des Chromophors dabei verändert wird Dies bietet beispielsweise Möglichkeiten zur kovalenten Immobilisierung des Indikators an Polymere [147] 78 Das miniaturisierte MachZehnderInterferometer In Abschnitt 71 wurde darauf verwiesen, dass sich chemische Sensormembranen mit einer maximalen optischen Empfindlichkeit im NIRSpektralbereich für die Verwendung auf optischen Chips, gefertigt aus IIIV Halbleitermatenahen eignen Nachdem nun eine Reihe von Chromoionophoren mit maximaler Lichtabsorption im langwelligen Spektralbereich in Optodenmembranen charakterisiert worden waren wurde in einigen Experimenten untersucht, wie sich eine NIRaktive Sensorschicht auf einem miniaturisierten MachZehnderInterferometer [148] als Messplattform verhalt Abbildung 732 zeigt den schematischen Aufbau des optischen Messsystems Phasenmodulator Laser Sensorfeld Detektor Abb 732 Schematische Darstellung eines monolithischintegrierten, chemischen Sensors in Form eines miniaturisierten MachZehnderInter ferometers Reproduziert mit Genehmigung nach [149] 78Das miniaturisierte MachZehnder Interferometer 183 Das vom Laser emittierte Licht wird auf die zwei Teilarme des Mach ZehnderInterferometers aufgeteilt Im Sensorfeld des Messarms werden Änderungen im Brechungsindex des benachbarten Mediums, in diesem Fall der Sensormembran, durch Änderungen der Phasengeschwindigkeit der optischen Mode registriert Die Interferenz mit dem Licht im Referenzarm wird am Detektor in ein elektrisches Signal umgewandelt [149] Dieser Messaufbau ermöglichte es, Brechungsindexdifferenzen in Flüssigkeiten mit einer Auflosung von An=l 3x10 szu erfassen Ändert sich aufgrund einer chemisch selektiven Wechselwirkung das Ab¬ sorptionsspektrum einer Optodenmembran, fuhrt dies gleichzeitig zu einer Änderung des Dispersionsspektrums Somit können Änderungen des Brechungsindex in der Optodenmembran direkt mit Variationen in der Aktivität eines Analyten in der Probelosung in Verbindung gebracht werden, wie auch experimentell von Freiner et al gezeigt wurde [35] Die Anwendung der KramersKronigTransformation auf gemessene Absorp¬ tionsspektren erlaubte die Abschätzung der Wellenlange maximaler Empfindlichkeit für die Erfassung von Brechungsindexanderungen in Optodenmembranen [150] Mit einer pHsensitiven Membran der Zusammensetzung M9 mit dem DicyanovinylIndikator als Chromoionophor, wurden erste Messungen auf einem miniaturisierten MachZehnderInterferometer (Lange 2mm) mit einem externen Detektor vorgenommen Die Sensorschicht wurde durch Tropfbeschichtung mit einer Micropipette auf den Chip aufgetragen Als Lichtquelle diente eine externe Laserdiode mit einer Emissionswellenlange von 830 nm Bei dieser Wellenlange wurden für die eingesetzte Membran die intensivsten Änderungen im Brechungsindex erwartet Dies ging aus berechneten Dispersionsspektren (Abb 733) hervor, die aus den gemessenen Absorptionsspektren (Abb 713) mittels eines Computerprogramms [151], basierend auf den KramersKronig Relationen erhalten wurden Es ist zu beachten, dass mit dieser Berech 184 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIRFARBSTOFFEN nungsmethode nur die erwarteten Änderungen An im Brechungsindex beschrieben werden und nicht die Absolutwerte 400 500600 700 800 900 Wellenlänge /nm Abb 733: Nach KramersKronig berechnete pHabhängige Dispersions¬ spektren (Änderungen des Brechungsindex) einer Optode der Zusammen¬ setzung M9 (vgl Abb 713) mit dem DicyanovinylFarbstoff als Chro¬ moionophor in einer DOSweichgemachten PVCMembran Im Verlauf der Experimente stiess man auf ein grundsätzliches Problem Der hohe molare dekadische Extinktionskoeffizient des Chromoionophors führte in Kombination mit der relativ hohen Konzentration in der Optodenmembran zu starken Intensitätsverlusten im Lichtwellenleiter Diese lagen im Bereich von 50 bis 100 dB cm"' und waren damit zu stark, um auf dem Detektor eine genügende Intensität zu registrieren Idealer¬ weise sollte die Dämpfung der Lichtintensität einen Wert von 20 dB cm"' 78 Das miniaturisierte Mach Zehnder Interterometer 185 nicht überschreiten, was für einen Wellenleiter aus Titandioxid mit einer Kerndicke von 70 nm einer Extinktion von 15 cm 'entspricht [152] Eine Reduktion der Verluste wäre nur dann möglich, wenn die Konzentration des Farbstoffes verringert wurde, was zu Lasten der Sensitivitat fallen wurde Bei zukunftigen retraktometnschen Sensoren konnte der Sensi tivitatsverlust durch ein höheres Auflösungsvermögen kompensiert werden Eine weitere Möglichkeit besteht dann, Chromoionophore mit niedrigeren Extinktionskoeffizienten einzusetzen ohne dass die Konzen¬ tration erniedrigt werden muss Von diesem Standpunkt aus betrachtet wurden sich die reduzierten DicyanovinylFarbstoffe ETHT 5003 5009 anbieten Gegenüber einer Verringerung der Konzentration des Farbstoffs haben die Chromoionophore ETHT 5003 5009 den Vorteil, dass die chemische Empfindlichkeit des Sensors unverändert bleibt, die optische Dichte der Membranschichten aber gleichzeitig reduziert wird Aut weitere Messungen musste im Rahmen dieser Arbeit verzichtet werden, da sich das interferometrische Messsystem selbst noch im Aufbau befand Vor allem war es noch nicht möglich, mit einer integrierten Lichtquelle und einem integrierten Detektor zu arbeiten Dadurch war das Auflösungsvermögen für die erwarteten kleinen Brechungsindexanderun gen der Sensormembranen bei reduzierter Farbstoffmenge noch nicht genügend 186 187 8 Ausblick Unsicherheiten beim Einsatz von chemischen Sensoren für klinische Messungen treten vor allem dann auf wenn die Analysenbefunde direkt mit Resultaten aus konventionellen Gesamtkonzentrationsbestimmungen verglichen werden Viele der beschriebenen Probleme konnten eliminiert werden, indem auf einen direkten Methodenvergleich verzichtet wurde, was aber die Einfuhrung einer neuen physikalischen Grosse mit einem neuen Referenzintervall und die Bereitstellung der zugehörigen Referenz matenahen erfordern wurde Ob sich auf dem Gebiet der klinischen Elektrolytanalytik die biologisch wichtige Grosse der aktiven Molalität durchsetzten wird, ist abzuwarten Sicher ist, dass bis heute kein bewusstes Umdenken stattgefunden hat und weiterhin Resultate aus direkten und indirekten Elektrolytmessungen unkritisch einander gegenübergestellt werden Auch in Expertenkreisen herrscht noch keine Einigkeit So wurden die Empfehlungen der IFCC [59] wahrend mehreren Jahren immer wieder abgeändert und angepasst Die IFCC verfasste bereits im Jahre 1986 einen Entwurf für den internen Gebrauch, der sich mit diesem Themenkreis befasste [58] Im Rahmen der Weiterentwicklung der optischen Messtechnik werden sich neue Möglichkeiten ergeben Mikrooptische Systeme basierend auf optischen Wellenleitern aus Polymermatenalien wie zum Beispiel Poly carbonat sind inzwischen entwickelt worden [153] Diese sind sehr kosten¬ günstig in der Herstellung und eignen sich fürdie Serienproduktion in grossen Stuckzahlen Eine weitergehende Integration aller Komponenten auf einem Chip wird die Grosse und die Kosten der Sensorsysteme zusätzlich reduzieren Der niedrige Preis durfte es gestatten, in Zukunft auch an die Konstruktion von Wegwerfmodulen (disposable chips) zu denken Die Entwicklung einer Disk ("Chemical Disk", CD) mit einer 188 AUSBLICK Reihe von optischen chemischen Sensoren in Form eines integrierten Sensorarrays, die von einem Gerat analog zu einem CompactDisk Spieler gelesen werden kann wird für die Zukunft vorgeschlagen [154] Vermehrtwerden neue, kostengünstige Laserdioden als Lichtquellen verfugbar Die Emissionswellenlange dieser Dioden ruckt immer weiter in den sichtbaren Wellenlangenbereich voi Dennoch wird die Nachfrage nach NIRIndikatoren bestehen bleiben, da ihre maximale optische Emp¬ findlichkeit ausserhalb des Absorptionsbereichs von interferierenden Komponenten in biologischen Proben hegt Die Forschung auf dem Gebiet der optischen chemischen Sensoren wird sich mit der Problematik der pH und der Ionenstarkeabhangigkeit befassen müssen Zwar weisen Optoden basierend auf dem Ionen¬ austausch und Koextraktionspnnzip eine Vielzahl von Vorteilen auf Dazu zahlen besonders die grosse Auswahl an Liganden und die Flexibilität bei der Wahl der Chromoionophore und der dadurch ermöglichten Anpassung des dynamischen Messbereiches Für den Einsatz für klinische Direktmessungen sind sie aber nur dann geeignet, wenn adäquate Methoden zur optischen pHErfassung zur Verfugung stehen Anstrengungen zur Entwicklung von direkten optischen Systemen, die nicht auf Ionenaustausch oder Koextraktion beruhen, sind im Gang Diese Art von Sensoren bedingt allerdings die Verwendung von selektiven, weitgehend pHunempfindlichen Chromoionophoren [155] für jeden Analyten [156163] Ferner kann in diesem Fall nicht mehr mit einem auf Ionenaustausch basierenden Membransystem (wassnge Probephase und organische Membranphase) gearbeitet werden, was spezielle Anforde¬ rungen an die Selektivität der Chromoionophore stellt 189 9 Experimenteller Teil 91 Klinische Untersuchungen 911 Probanden Proben wuiden von 36 freiwilligen Probanden der ETH Zürich, sowie des Untversitatsspitals Zürich, welche sich als gesund bezeichneten, unter den folgenden Bedingungen entnommen Die Spender fanden sich morgens um 8Uhr mit nüchternem Magen und ohne den Konsum von Alkohol wahrend der vorangehenden 12 Stunden ein Weiter wurde Blut von 18 Patienten mit Nierenbeschwerden unmittelbar vor der Behandlung durch Hämodialyse und von 15 Patienten nach dei Behandlung durch Hämodialyse entnommen Schliesslich standen Pioben von 15 Patienten aus der Intensivstation für innere Medizin, welche an verschiedenen Herz¬ problemen litten oder sich einer Herzoperation zu unterziehen hatten (Herzinfarkt, instabile Angina Pectoris, Einsatz eines aortokoronaren Bypasses und perkutane, transluminale koronare Angioplastik) zur Verfugung Von den insgesamt 82 Blutspendern waren 52 männlich und 30 weiblich Die Altersverteilung variierte je nach Probandengruppe und lag zwischen 21 und 50 Jahren bei den Gesunden, 28 und76 Jahren bei den Hamodialysepatienten und zwischen 42 und 80 Jahren bei den Patienten mit Herzbeschwerden 912 Probenahme Alle Proben wurden in hepannisierten (LiHepannat, 143 USP Einheiten) 10ml VacutainerRohrchen (BectonDickmson, Rutherford NJ, USA) gesammelt, wahrend die Probanden sassen oder lagen An¬ schliessend erfolgte eine Markierung mit Strichcoden, um 190 EXPERIMENTELLER TEIL Verwechslungen auszuschhessen Die Entnahmerohrchen wurden rotiert, um eine vollständige Durchmischung mit dem Heparmat zu gewährleisten Plasma wurde entweder unmittelbar nach oder vor der Analyse der Probe auf dem Laborautomaten (siehe Abschnitt 913) ungefähr eine Stunde nach der Zentnfugation abgetrennt Anaerobe Probenhandhabung war aus technischen Gründen nicht möglich Die Plasmaproben wurden bis zur weiteren Analyse bei 4°C gelagert Nach der Beendung aller Analysen wurden die Proben mit flussigem Stickstoff schockgefroren und unterhalb von 20 °C aufbewahrt 913 Verwendete Gerate und Methoden Die im folgenden aufgeführten Analysen wurden auf einem Hitachi 747 Analyzer (Boehnnger Mannheim Diagnostics Ine ,Houston, TX, USA) ausgeführt Totale Ionenkonzentrationen von Natrium,Kalium, Calcium, Magnesium und Chlorid, Gesamtprotein, Cholesterin, Glucose, Hainstoff und Triglyceride Die Phosphohpide wurden auf einem COBAS FARA Gerat (Hoffmann LaRoche Diagnostica, Basel) bestimmt Die freien Ionenkonzentrationen von Natrium und Kalium bestimmte man mit einem AVL 985S Elektrolytanalyzer (AVL List GmbH, Graz, Osterreich) wahrend die freien Ionenkonzentrationen von Calcium und Magnesium, sowie der pHWert mit einem AVL988 Analyzer erfasst wurden Die angewandten analytischen Methoden sind in Tabelle 91 zusammengefasst Alle Tests wurden gemäss den Vorschriften der jeweiligen Geratehersteller durchgeführt 91Klinische Untersuchungen 191 Tabelle 91 Klinische Analysemethoden Alle Tests wurden bei 37 °C nach den Anweisungen des Gerateherstellers durchgeführt Analyt Methode Natrium Gesamtkonz Natrium freie lonenkonz Kalium Gesamtkonz Kalium freie lonenkonz Calcium Gesamtkonz Calcium freie lonenkonz Magnesium Gesamtkonz Magnesium freie lonenkonz Chlorid Cholesterin Gesamtproteine Glucose Harnstoff Triglyceride Phosphohpide pH Indirekte Potentiometrie (ISE) Direkte Potentiometrie (ISE) Indirekte Potentiometrie (ISE) Direkte Potentiometrie (ISE) Photometnsch (546 nm) oKresolphthaleinkomplex Direkte Potentiometrie (ISE) Photometrisch (505 nm) Xylidylblaukomplex Direkte Potentiometrie (ISE) Indirekte Potentiometne (ISE) Enzymatisch, photometrisch (505 nm) CholestennoxidasePAPMethode Photometnsch (546 nm) BiuretMethode Enzymatisch, photometnsch (505 nm) Peridochrom® (Boehnnger Mannheim) GlukoseoxidasePAPMethode Enzymatisch, kinetischer UVTest (340 nm) UreaseGLDH Enzymatisch, photometnsch (505 nm) GPOPAP Enzymatisch, photometnsch (505 nm) Phosphohpase D, Chohnoxidase, Peroxidase Direkte Potentiometrie (ISE) 192 EXPERIMENTELLER TEIL 914 Kahbrationsmethoden Der Hitachi 747 Analyzer wurde durch eine Einpunktkahbration mit einem biologischen (Serum) Standard kalibriert (Calibrator for Auto mated Systems Nr 759350, Boehnnger Mannheim GmbH, Mannheim Deutschland) Das COBAS FARA Gerat zut Phosphohpidbestimmung wurde ebenfalls durch eine Einpunktkahbration mit einem Standardserum kalibriert (Wako Chemicals GmbH, Neuss Deutschland) Im Falle der AVL Elektrolytgerate erfolgte die Kalibration an mindestens 2Punkten durch wassnge Standardlosungen (AVL Standard A, B, Cund D) 915 Qualitätskontrolle Die Präzision und die Richtigkeit der Analysen am klinischen Laboratorium des Universitatsspitals Zürich wird routinemassig mittels Kontrollseren Precinorm0 U und Precipath0 U (Boehnnger Mannheim GmbH, Mannheim, Deutschland), mittels sekundären, zertifizierten Refe renzmatenahen für lonenselektive Elektroden (Pferdeserum) (Chemicals Inspection & Testing Institute, Tokyo, Japan, Lot No W 901) sowie durch Vergleiche mit anderen Labors überwacht Die erhaltenen Mess¬ werte für Quahtatskontrollproben, welche regelmassig analysiert wurden, lagen alle innerhalb ihrer vorgegebenen Toleranzintervalle Für den AVL988 Analyzer wurden zusatzlich wassnge Standardlosungen für die Richtigkeitskontrolle verwendet Zur Sicherung der Präzision wurde ein Poolplasma, hergestellt durch Mischung von frischen Humanplasmen, ab gefüllt in Portionen zu wenigen Millilitern und gelagert unterhalb 20 °C eingesetzt Für die Analyse wurde jeweils eine Probe aufgetaut, zen tnfugiert und insgesamt 5bis 15 mal (in Abhängigkeit des Analyten) wahrend der gesamten experimentellen Phase vor und nach einer Serie von unbekannten Proben analysiert Die analytische Variation des Hitachi 92Zusammensetzung und Herstellung von Optodenmembranen 193 747 Analyzers wurde durch Auswertung der Resultate der Poolplasmen über die gesamte experimentelle Phase abgeschätzt Sie lag unterhalb von einem Prozent (95% Vertrauensintervall) für Natrium, Kalium, Chlorid, Gesamtprotein und Cholesterin und mit Ausnahme von Harnstoff (3 9%, 95% Vertrauensintervall) unterhalb von zwei Prozent für alle anderen Analyte Für die AVL Elektrolytanalyzer erhielt man Variationen unterhalb einem Prozent für Natrium und für Kalium wahrend sie für Calcium und Magnesium zwei Prozent betrugen 92 Zusammensetzung und Herstellung von Optodenmem¬ branen 921Optodenmembranen basierend auf PVC und OHPVC Als Membranbestandteile verwendete man Liganden, Weichmacher und Zusätze der Qualitatsstufe Selectophore0 der Firma Fluka AG (CH 9470 Buchs) Die eingesetzten Farbstoffe stammten aus der eigenen Synthese oder wurden als Proben zur Verfugung gestellt Die Ver¬ bindungen IR125 (Eastman Kodak, Rochester NY, USA) und HITCI (Aldrich, CH 9470 Buchs) wurden bei den genannten Herstellern bezogen Sämtliche Membrankomponenten wurden in ein Glaschen mit Gewinde verschluss eingewogen Die detaillierte Zusammensetzung findet man im Anhang 1 Der Weichmacher und die Polymermatrix wurden immer im Gewichtsverhaltnis 21eingesetzt Das Gesamtgewicht aller Membranbe standtede (mit Ausnahme des Losungsmittels) betrug 167 mg Falls nicht anders vermerkt, wurde jeweils 1ml frisch destilliertes THF zugesetzt und bis zur vollständigen Losung auf einem Schuttler gemischt Von der resultierenden Losung wurden ca 04 ml mit einer Glasspritze auf¬ gezogen und mit Hilfe eines Spin on Gerätes [164] auf eine rotierende 194 EXPERIMENTELLER TEIL Tragerscheibe aus Herasd® Quarzglas (Moller AG, CH8050 Zürich) aufgespritzt Durch Variation der Rotationsgeschwindigkeit oder der Vis¬ kosität des Membrancocktads, war es möglich, die Membrandicke zu beeinflussen [80] In der Regel wurde mit Membranen von 23 pm Dicke gearbeitet Die Herstellung der Sensormembranen erfolgte in einer LaminarflussZelle vom Typ Biocyt Modell 95 (Flufrance, Wissous, Frankreich), welche eine weitgehend staubfreie Umgebung gewährleistete Jeweils2 Membranen auf 2Tragerscheiben wurden in einer Durchfluss messzelle [81] zu einem Sensor kombiniert Fui Messungen im ATRModus wurde ein SaphirReflexionselement von 1mm Dicke und 52 mm Lange mit der Optodenmembran beschichtet und in eine spezielle Durchflussmesszelle eingesetzt [165] Beide Typen von Durchflussmesszellen waren für Messungen in kommerziellen UV/VIS Spektrophotometern (Kap 94) adaptiert 922 Optodenmembranen aus Nafion 400 pl einer 0001 mol L~' Losung des zu untersuchenden Farbstoffes (siehe Anhang 1) in Methanol wurden mit 600 pl einer ge¬ brauchsfertigen 5% Nafion Losung in niedrigen aliphatischen Alkoholen und Wasser (Aldnch, CH9470 Buchs) gemischt Von dem resultierenden Membrancocktail wurden dann 200 pl mit Hilfe einer Spritzennadel gleichmassig über eine QuarzTragerplatte verteilt Diese wurden gegen Licht und Staub geschützt abgedeckt, und man liess das Losungsmittel über Nacht verdampfen Obwohl diese Membranschichten nicht die gleiche Homogenitat wie mit dem SpinonVerfahren hergestellte Mem¬ branen aufwiesen, waren sie für optische Absorptionsmessungen geeignet 93Messlosungen und Kalibratoren 195 93 Messlösungen und Kalibratoren Für die Herstellung von Pufferlosungen und Kalibratoren verwen¬ dete man Metallsalze von höchstmöglicher Reinheit der Firmen Fluka AG (CH9470 Buchs), sowie Merck (D6100 Darmstadt, Deutschland) Alle Losungen wurden mit zweifach destilliertem Wasser mit einer Leitfähig¬ keit unter 1uS /cm angesetzt, das mit einer Destdlationsanlage vom Typ Buchi Fontavapor 285 (Buchi LaboratoriumsTechnik, CH9230 Flawd) aufbereitet wurde Die Zusammensetzung der wassrigen, sowie der methanohschen Pufferlösungen wurde in den meisten Fallen aus dem Werk von Pernn und Dempsey [166] entnommen Für die Ca2+Bestimmung in Vollblut wurdenwassnge Kalibratoren mit physiologischem lonenhintergrund eingesetzt Die Konzentrationen orien¬ tierten sich an den mittleren physiologischen Molalitäten, wie sie in Hu¬ manplasmen angetroffen wurden (Na+ 150 mmol kg"', K+ 43mmol kg ', Mg2+ 051 mmol kg ') Alle Ionen wurden in Form der Chlondsalze eingebracht Zur Stabilisierung des pHWertes wurde die Losung mit 10 mmol kg 'HEPES auf pH 740 gepuffert Es wurden die folgenden Ca2+Konzentrationen eingestellt Kl 054 mmol kg"', K2 118 mmol kg ' und K3 268 mmol kg"1 Die Vollblutproben wurden auf analoge Weise entnommen, wie im Abschnitt 912beschrieben Es wurde ausschliesslich das eigene Blut verwendet Die Universalpuffer (Kapitel 77) wurden aus einer Stammlosung ange¬ setzt (HßO,, KH,P04 und KCl je 1mol L"') und der gewünschte pHWert mit 1mol L 'KOH eingestellt Anschliessend verdünnte man auf eine Konzentration von 01mol L"1 196 EXPERIMENTELLER TEIL 94 Messgerate Alle Einwaagen wurden auf Präzisionswaagen der Firma Mettler Toledo (MettlerToledo AG, CH8606 Greifensee) durchgeführt Für die Einwaage von Optodenmembrancocktails wurde ein Gerat mit einer Genauigkeit von ±0 01 mg (AT261 Delta Range") eingesetzt Für die pH Einstellung der Pufferlosungen verwendete man ein Orion Modell 920 A pHMeter mit einer Glaselektrode vom Typ 8103 Ross° (ATI Orion, Boston MA, USA) Für die Aufzeichnung der Absorptionsspektren benutzte man ein UV/VISZweistrahlSpektrophotometer vom Typ Uvikon942 (Kontron Instruments, CH8010 Zürich) oder Hitachi U3210 (Hitachi Ltd ,Tokyo, Japan) mit den adaptierten Durchflussmesszellen Die Forderung der Probelosungen im Schlauchsystem der Durchfluss messzelle erfolgte mit einer Penstaltikpumpe des Typs Perpex Jubile (Guldener, CH 8047 Zürich) in der Regel mit einer Geschwindigkeit von 15ml min ' 95 Computersoftware und hardware Die Verarbeitung der aufgezeichneten spektralen Daten erfolgte mit den Softwarepaketen Igor Pro 303 (WaveMetncs Ine ,Lake Oswego, Oregon, USA) oder teilweise auch MicrosoftExcel 50(Microsoft Corp , Seattle, USA) Für die statistische Datenauswertung verwendete man Systat 521(Systat, Ine ,Evanston IL, USA) In allen Fallen wurden Personal Computer vom Typ Apple Macintosh (Apple Computer Ine , Cupertino CA, USA) eingesetzt PPPBerechnungen wurden mit dem Programm QCPE (Quantum chemistry program exchange) Nr 641 [167] auf einer Silicon Graphics Indigo 2xz Workstation (Silicon Graphics Ine , Mountain View CA, USA) durchgeführt 96 Verwendete Abkürzungen 197 96 Verwendete Abkürzungen Abkürzung Bedeutung ATR Abgeschwächte Totalreflexion (attenuated total reflection) C Chromoionophor, Farbstoff Cl Configuration Interactwn Crocontum 2[4(Diethylamino)2hydroxyphenyl]5[4(l,ldiethyl Indikator ammonium)2hydroxy2,5cyclohexadienyhden]3,4 dioxo1 cyclopenten1 olat Dicyanovinyl l,3Bis(dicyanomethylen)2[4'(A,A'diethylamino) Indikator phenyhmino]indan DOS Bis(2ethylhexyl)sebacat, Membranweichmacher EMK Elektromotorische Kraft ETH 1001 [(MR^^A'BistlHethoxycarbonyDundecylJAgV' 4,5tetramethyl3,6dioxaoctandiamid, Calciumionophor ETH 5350 MAf(Diethyl)5[(2octyldecyl)imino]5//benzo[a] phenoxazin9amin ETHT 5003 2[3Dicyanomethylen2(4[bis(2ethylhexyl)amino] phenylamino)indan1 yliden]malononitnl ETHT 5004 2{2[{4[Bis(2ethylhexyl)amino]phenyl }(4tertbutyl phenyl)amino]3dicyanomethylenindan1 yliden} malono nitnl ETHT 5005 Spiro[{ l,3bisdicyanomethylemndan}2,2'{ l'(4[bis (2ethylhexyl)amino]phenyl)pipendin} ] ETHT5006 [4((l,3Bisdicyanomethylenindan2yl){4[bis(2ethyl hexyl)amino]phenyl}amino)butyl]tnphenylphosphonium lodid 198 EXPERIMENTELLER TEIL ETHT 5007 VAdamantanlylA7'(l,3bisdicyanomethylenindan2 yl)A/'{4[bis(2ethylhexyl)amino]phenyl)malonamid ETHT 5008 NAdamantan1 y\N( 1,3bisdicyanomethylenindan2 yl)Ar{4[bis(2ethylhexyl)amino]phenyl}Amethyl malonamid ETHT 5009 V(l,3Bisdicyanomethylemndan2yl)A'{4[bis(2 ethylhexyl)amino]phenyl}2,4,6trnsopropylbenzolsulfon amid GLDH Glucosedehydrogenase GPO Glycerophosphatoxidase HITCI 1,1 ',3,3,3',3'Hexamethyl2,2'indotncarbocyaniniodid IFCC International Federation ofClinital Chemistrv IR125 Anhydro1,1 dimethyl2[7[ 1,1 dimethyl3(4sulfo butyl)2(l//)benz[elindohnyhden]l,3,5heptatnenyl]3 (4sulfobutyl)l//benz[e]indohumhydroxid Natriumsalz ISE lonenselektive Elektrode KTFPB Kahumtetrakis[3,5bis(trifluorornethyl)phenyl]borat, R L lonophor, Ligand MTDDACl Methyltridodecylammomumchlorid, R+ NaTFPB Natnumtetrakis[3,5bis(tnfluoromethyl)phenyl]borat, R NIR Nahes Infrarot OHPVC Hydroxypoly(vinylchlond) «NPOE 2Nitrophenyloctylether, Membranweichmacher PAP pAminophenazon PDCC104 [l,5Bis(pdimethylaminophenyl)2,4 pentadienyljcarbeniumperchlorat 96Verwendete Abkürzungen 199 pHCOOHBr 5Carboxy2(2 {3[2(5carboxy 1ethyl1,3dihydro 3,3dimethylmdol2yliden)ethyliden]2chloro1 cyclo hexen1 yl} vinyl)1 ethyl3,3dimethyl3//indohum bromtd PPP PanserParrPople Propylen 4Methyll,3dioxolan2on, Membranweichmacher carbonat PVC Poly(vinylchlond) QCPE Quantum chemistry program exchange R+ Lipophiler kationischer Zusatz (in der Regel MTDDACl) R Lipophiler anionischer Zusatz (in der Regel KTFPB oder NaTFPB) Squann 2[2,2Diethyl1,2dihydro6//penmidinium6yliden]4 Indikator [2,2diethyl2,3dihydro1 //penmidin6yl]3oxo1 cyclobuten1olat THF Tetrahydrofuran Trimethimum [6(2(9Acndinyl)vinyl)7,8,9,10tetrahydro5oxa Indikator cyclohepta[b]naphthahn3yl]diethylamin 200 201 10 Literatur [1] A Hulanicki, S Glab und F Ingman Chemical sensors definitions and Classification, Pure & Appl Chem 63 (9), 12471250 (1991) [2] K Doerffel, R Geyer und H Muller Analytikum Methoden der analytischen Chemie und ihre theoretischen Grundlagen, Deutscher Verlag für Grundstoffindustrie, Leipzig (1994) [3] U E Spichiger, D Citteno und J Spichiger Prozessanalytik mit chemischen Sensoren, Technische Systeme für Biotechnologie und Umwelt, Institut für Bioprozess und Analysenmesstechmk eV ,8 Heihgenstadter Kolloquium, Heiligenstadt, 200206 (1996) [4] M R Neuman Medical diagnostics andpatient monitoring, in der Reihe W Göpel, J Hesse und J N Zemel Sensors A compre hensive survey, in T Grandke und W H Ko Fundamentals and general aspects, Bd 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Gesamtmasse die auf sich beziehen Konzentrationsangaben Alle Optodenmembranen der Zusammensetzung 1 Anhang oz>X > PVC OHPVC OHPVC PVC PVC Polymer 25 DOS KTFPB 26 oNPOE NaTFPB 26 oNPOE NaTFPB 50 oNPOE NaTFPB 42 oNPOE NaTFPB kg"'] [mmol Weichmacher Additiv 20 Squarin 31 10 5234 ETH pHCOOH+ 31 10 5234 ETH PDC+ 117 38 1001 ETH pHCOOH+ 58 19 1001 ETH PDC+ M8 M7 M6 M5 M4 kg" [mmol kg"1] [mmol Ligand Chromoionophor MembranTyp 25 PVC Propylencarbonat KTFPB 25 PVC Propylencarbonat KTFPB 25 PVC oNPOE KTFPB 25 PVC oNPOE KTFPB 25 PVC DOS KTFPB kg"1] [mmol Polymer Weichmacher Additiv Dicyanovinyl M13 20 Squarin M12 20 Dicyanovinyl Mll 20 Squarin MIO 20 Dicyanovinyl M9 kg"'] [mmol kg"'] [mmol Ligand Chromoionophor MembranTyp 10 PVC DOS MTDDAC1 2 PVC DOS MTDDAC1 o 20 £ PVC DOS MTDDAC1 20 PVC DOS NaTFPB 16 PVC DOS KTFPB kg"1] [mmol Polymer Weichmacher Additiv 20 5004 ETHT Ml8 20 5004 ETHT M17 20 ETHT5003 M16 45 17 1001 ETH Trimethinium 5 Ml 15 Trimethinium M14 kg"'] [mmol kg"'] [mmol Ligand Chromoionophor MembranTyp PVC DOS PVC DOS PVC PVC PVC 40 DOS MTDDAC1 30 DOS MTDDAC1 20 DOS MTDDAC1 '] kg [mmol Polymer Weichmacher Additiv 20 5009 ETHT M23 13 5006 ETHT M22 20 5004 ETHT M21 205004 ETHT M20 20 5004 ETHT M19 kg"'] [mmol kg"'] [mmol Ligand Chromoionophor MembranTyp PVC DOS 20 PVC DOS MTDDAC1 20 PVC DOS MTDDAC1 kg"1] [mmol Polymer Weichmacher Additiv 1001 ETH ETHT5009 M26 205008 ETHT M25 20 5007 ETHT M24 kg"'] [mmol kg"'] [mmol Ligand Chromoionophor MembranTyp 225 Anhang 2 Tabelle 1Gemessene Rohdaten für Blutplasma von 82 Probanden, Status G=gesunde Probanden VD =Patienten vor der Hämodialyse, ND =Patienten nach der Hämodialyse, HV =Patienten mit Heizbeschwerden auf der Intensivstation für innere Medizin, Jhg Jahrgang des Piobanden, t* b° Totale Ionenkonzentration gemessen mit Hitachi 747 Analyzer inmmol L,', llx, c,'4' Aktive Molalitat gemessen auf AVLElektrolytanalyzer in mmol kg,,' „und gerateintern transformiert zur freien Ionenkonzentration, ausgedruckt inmmol L,'r ht,Hkt HamatokntWert, Osmol Osmolalitat Nr Status Sex Jhg c\h c[' c\b c^K c'[^ [mmol L'][mmol L'][mmol L'][mmol L'][mmol L'] 1 G m 65 140 0 147 1 38 40 105 2 G 1 59 1400 146 9 44 46 107 3 G m 69 140 0 147 7 41 43 104 4 G m 60 142 0 148 2 3 5 37 107 5 G m 67 141 0 148 7 37 38 107 6 G m 67 142 0 148 1 44 46 104 7 G m 63 144 0 149 7 41 42 105 8 G f 65 142 0 148 3 39 41 108 9 G 1 62 141 0 148 6 37 39 107 10 G m 62 142 0 149 1 3 8 40 105 11 G f 61 1390 145 1 39 41 107 12 G m 66 141 0 149 3 37 39 106 13 G f 68 1400 147 2 3 9 42 105 14 G m 67 1420 149 8 38 40 106 15 G f 66 140 0 148 0 43 45 105 16 G m 66 141 0 148 3 38 40 107 17 G m 65 143 0 150 3 41 43 105 18 G m 65 141 0 148 7 37 39 104 19 G m 63 145 0 151 5 42 44 110 20 G m 65 1400 147 5 43 45 103 21 G m 62 1400 146 6 43 45 102 22 G m 69 141 0 148 2 41 43 107 23 G m 67 142 0 149 1 32 39 103 24 G m 67 1410 149 5 39 40 104 25 G f 57 1400 148 3 41 43 107 26 G f 63 141 0 149 8 42 45 106 27 G f 43 141 0 148 2 38 40 103 28 G f 71 141 0 146 1 44 46 102 29 G f 70 142 0 146 8 4446 108 30 G f 72 1400 145 9 41 43 104 31 G f 71 143 0 148 6 43 45 109 32 G f 70 140 0 146 7 43 45 108 226 ANHANG 2 Tabelle 1Fortsetzung Nr Status Sex Jhg c\^ <;_' c"^ <^ c'uh [mmol L'][mmol L'][mmol L'][mmol L'][mmol L'] 33 G f 68 139 0 144 8 44 46 106 34 G f 71 140 0 147 1 37 39105 35 G m 72 142 0 147 5 40 41 108 36 G f 70 141 0 147 238 39 108 37 VD m 36 133 8 139 4 57 59 99 38 VD m 26 135 9 143 0 63 66 103 39 VD m 41 138 6 146 5 48 51 104 40 VD m 32 138 7 146 2 47 49 103 41 VD f 34 139 2 147 4 56 60 106 42 VD f 49 134 0 140 8 54 58 93 43 VD m 31 135 9 144 7 61 66 98 44 VD m 22 135 8 144 1 57 61 97 45 VD f 43 134 2 140 6 6 1 64 98 46 VD f 58 137 2 142 5 70 73 100 47 VD m 17 136 9 143 7 44 47 98 48 VD m 50 140 6 147 6 48 51 104 49 VD f 59 140 6 146 4 45 47 103 50 VD m 64 140 5 148 0 50 53 104 51 VD m 67 139 8 146 9 46 48 96 52 VD m 47 135 2 142 0 69 7 3 102 53 VD f 58 138 2 145 5 5 9 62 102 54 VD m 65 141 4 148 85 0 52 108 55 ND m 41 140 3 148 9 41 44 101 56 ND m 26 138 0 144 7 39 41 100 57 ND m 32 140 0 149 1 37 40 100 58 ND m 36 1394 145 6 32 35 102 59 ND m 31 140 0 148 0 36 38 102 60 ND m 22 138 2 146 7 49 52 101 61 ND t 49 138 2 146 1 39 41 99 62 ND f 34 139 5 146 6 43 45 102 63 ND f 43 136 4 142 1 47 49 100 64 ND m 67 139 8 149 8 36 39 101 65 ND m 47 138 7 148 8 41 44 101 66 ND m 64 139 6 148 0 43 48 104 67 ND f 58138 8 149 1 41 43 100 68 HV m 51 131 0 135 5 44 46 102 69 HV f 26 137 0 143 1 41 43 101 70 HV m 24 139 0 145 7 41 43 103 71 HV m 13 132 0 135 9 42 44 96 72 HV f 28 142 0 150 1 42 44 105 73 HV m 16 135 0 141 3 48 5 1 100 74 HV t 26 129 0 136 1 43 46 93 75 HV m 28134 0 147 8 34 41 98 76 HV m 28 133 0 145 3 38 46 94 77 HV m 38 137 0 144 6 43 41 105 78 HV m 25 140 0 147 8 45 48 111 •^r uoo ^ 33 ^r ^7;o_33 ^r / r ^To rv 33 '~Jr ±^o ^ 33 —• y r ^O fr 3 3 t UQrr<—i Xor/iV^CA "*z O—tou> *U)4^4^ toooo U>U>4^ 4^ \o00\Q— Jto—O ooo oUlslCOO 3 3 3 3 <<<< XXX X UJ—[O—woo<^toO4^J 00W00O0000vJ4iOOWWJ>slU\0^^OW0M JoCTn\o— 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OttenoLabitzke in Zürich, Burger von Zürich 19741979 Primarschule in Zürich 19801986 Literargymnasium Ramibuhl in Zürich, Matura Typus B 19861987 Certificate of Proficiency in Enghsh an der McGdl University Montreal (Kanada) 1987 Militärdienst (FebruarNovember) 19871992 Studium an der Eidgenossischen Technischen Hoch schule (ETH) Zürich, Abt IV (Chemie) 1991 Ausbildung zum Strahlenschutzsachverstandigen am PaulScherrerInstitut (PSI) Wurenlingen 1992 Diplom der ETH Zürich, Diplomarbeit in der Arbeitsgruppe von Prof Dr Wilhelm Simon 19921993 Anstellung bei der ANAWA AG in Wangen (ZH), Pharmakokinetische Studien (GC / HPLC) kommerzieller Pharmaka 19931997 Doktorarbeit in der Arbeitsgruppe von Prof Dr Gerd Folkers unter der Leitung von PD Dr Ursula E Spichiger am Zentrum für Chemische Sensoren, ETH Zürich 1996 Stipendiat der Masuda Foundation in der Arbeitsgruppe von Prof Dr Yoshio Umezawa (AugustNovember), School of Science, University of Tokyo (Japan) 236 LEBENSLAUF 19941997 Praktikumsassistent in analytischchemischen Praktika an der ETH Zürich sowie der Ingenieurschule Wadenswd (ISW) 1998 Postdoktorat in der Arbeitsgruppe von Prof Dr Koji Suzuki, Keio University, Yokohama (Japan)

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